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yiren12689

新虫 (初入文坛)

[交流] 做过RED同源重组的大侠们请进!已有5人参与

做过RED同源重组的大侠们请进,PKD46拷贝数低,提出的量总是不高,怎么转也转不到我的目的菌迟缓爱德华菌里面去,我用的氯化钙法,也不知道是不是感受态的问题怎么办啊,做好长时间做不出来,不知道是什么问题啊?
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yiren12689

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-03-06 14:30:51
线性片段浓度太低了?而且,一般表达pKD46的感受态现做现用效果最好,因为它表达了重组酶,放久了活性也会受到影响...

电转的话,用甘油法做感受态,我感觉甘油法没有氯化钙法效果好?
感受态细胞和线性DNA大概多少比例关系?DNA浓度得达到多少?
电转仪参数是不是有要求?
10楼2014-03-10 15:49:17
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zy_696969

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
木虫/panda: 金币+1, 鼓励交流,欢迎常来农林版 2014-03-06 15:26:04
1、试试电转化?
2、如果觉得感受态不好的话可以先做个阳性对照,或者直接买Takara之类公司的感受态。
3、我从其它实验室接过来的冻存是质粒pKD46保存在菌株BW25113中的。可以找下相关文献看有没有把pKD46转到你的那株菌里。
我最近也在吭哧吭哧地做RED同源重组,但是还没有实质进展,一起加油哇。↖(^ω^)↗
2楼2013-10-14 15:09:01
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我觉得是你的感受态的问题,我们转到BL21里面很成功的~
3楼2014-02-27 17:12:10
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yiren12689

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-02-27 17:12:10
我觉得是你的感受态的问题,我们转到BL21里面很成功的~

现在质粒是转进去了,但是同源重组的线性DNA老是电转不进去
4楼2014-03-06 10:16:08
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