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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 畜牧兽医 » 做过RED同源重组的大侠们请进！
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yiren12689

新虫 (初入文坛)

[交流] 做过RED同源重组的大侠们请进！ 已有5人参与

做过RED同源重组的大侠们请进，PKD46拷贝数低，提出的量总是不高，怎么转也转不到我的目的菌迟缓爱德华菌里面去，我用的氯化钙法，也不知道是不是感受态的问题怎么办啊，做好长时间做不出来，不知道是什么问题啊？
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1楼 2013-07-11 10:01:09
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zy_696969

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木虫/panda: 金币+1, 鼓励交流，欢迎常来农林版 2014-03-06 15:26:04
1、试试电转化？
2、如果觉得感受态不好的话可以先做个阳性对照，或者直接买Takara之类公司的感受态。
3、我从其它实验室接过来的冻存是质粒pKD46保存在菌株BW25113中的。可以找下相关文献看有没有把pKD46转到你的那株菌里。
我最近也在吭哧吭哧地做RED同源重组，但是还没有实质进展，一起加油哇。↖(^ω^)↗
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2楼2013-10-14 15:09:01
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zy_696969

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5楼: Originally posted by yiren12689 at 2014-03-06 10:17:41
现在质粒是转进去了，但是在转同源片段线性DNA又转不进去了，你现在进展如何？有什么好方法...

跟你卡在同一个地方~
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7楼2014-03-06 16:32:59
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蝶影拂袖

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我觉得是你的感受态的问题，我们转到BL21里面很成功的~
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3楼2014-02-27 17:12:10
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yiren12689

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-02-27 17:12:10
我觉得是你的感受态的问题，我们转到BL21里面很成功的~

现在质粒是转进去了，但是同源重组的线性DNA老是电转不进去
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4楼2014-03-06 10:16:08
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yiren12689

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by zy_696969 at 2013-10-14 15:09:01
1、试试电转化？
2、如果觉得感受态不好的话可以先做个阳性对照，或者直接买Takara之类公司的感受态。
3、我从其它实验室接过来的冻存是质粒pKD46保存在菌株BW25113中的。可以找下相关文献看有没有把pKD46转到你的 ...

现在质粒是转进去了，但是在转同源片段线性DNA又转不进去了，你现在进展如何？有什么好方法
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5楼2014-03-06 10:17:41
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)
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木虫/panda: 金币+1, 鼓励交流，欢迎常来农林版 2014-03-06 15:26:29
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4楼: Originally posted by yiren12689 at 2014-03-06 10:16:08
现在质粒是转进去了，但是同源重组的线性DNA老是电转不进去...

线性片段浓度太低了？而且，一般表达pKD46的感受态现做现用效果最好，因为它表达了重组酶，放久了活性也会受到影响
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6楼2014-03-06 14:30:51
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yiren12689

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by zy_696969 at 2014-03-06 16:32:59
跟你卡在同一个地方~...

也是电转吗？你们有没有用自杀性质粒做敲除的？
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8楼2014-03-06 19:09:13
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zy_696969

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8楼: Originally posted by yiren12689 at 2014-03-06 19:09:13
也是电转吗？你们有没有用自杀性质粒做敲除的？...

嗯，产同源重组酶的质粒是pKD46，线性打靶片段是以pKD3为模板的。
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9楼2014-03-07 13:15:27
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yiren12689

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-03-06 14:30:51
线性片段浓度太低了？而且，一般表达pKD46的感受态现做现用效果最好，因为它表达了重组酶，放久了活性也会受到影响...

电转的话，用甘油法做感受态，我感觉甘油法没有氯化钙法效果好？
感受态细胞和线性DNA大概多少比例关系？DNA浓度得达到多少？
电转仪参数是不是有要求？
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10楼2014-03-10 15:49:17
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