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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于基因表达
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孙妙妙

金虫 (小有名气)

[求助] 关于基因表达

自己克隆了一个植物基因，现在想在大肠感觉中表达它。但是不知道要怎么设计表达时用的引物？酶切位点怎么加？怎么考虑移码问题？准备选用peT30b作为表达载体，BL21为宿主菌，同时分析我的序列和载体序列及实验室情况，准备选择BamHI和NotI做双酶切，现在不知道酶切位点要怎么加在引物上，请各位大侠帮忙，谢谢！
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好好做实验！
1楼 2013-07-09 17:30:09
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回帖置顶 ( 共有1个 )

lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
孙妙妙: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，最起码有一点明白了 2013-07-09 19:35:08
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-09 21:31:33
1949stone: 回帖置顶 2013-07-10 08:38:28
我前段时间也在研究这个问题，在此说一下我的经验，
   按2楼说的，可在上下游引物的5'端各加一个酶切位点，同时最好保护碱基，具体数目你可以下载相关资料来看，这样PRC后就可以在目的片段上加上酶切位点了。到时用这两个酶来分别对载体和目的片段双酶切，回收纯化，再连接，转化，测序判断是否连接正确，再进行表达。
    你可以先借助软件，如Vector NTI来分析一下是否移码的问题，你需研究下你的表达载体是从哪里开始翻译的，然后，插入你的目的片段后，从载体翻译的起始按三个碱基来分析一下你的CDS区有无移码，没有就好。
    有大牛觉得我的说法不对的，欢迎指出并一起交流。
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思路决定出路。。。
3楼2013-07-09 18:43:18
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普通回帖

白色毛衣

银虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-09 21:31:51
做表达的话，引物比较好设计，因为基因序列已经确定了，你在PCR引物设计的时候直接加上去就行吧，上游下游各加一个酶切位点，一般来说在酶切位点的前面加上保护性碱基
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资源共享
2楼2013-07-09 17:55:55
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孙妙妙

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 白色毛衣 at 2013-07-09 17:55:55
做表达的话，引物比较好设计，因为基因序列已经确定了，你在PCR引物设计的时候直接加上去就行吧，上游下游各加一个酶切位点，一般来说在酶切位点的前面加上保护性碱基

这个我知道，我就是不晓得是不是直接紧挨着起始密码加，还有就是怎么考虑移码不移码
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好好做实验！
4楼2013-07-09 19:33:47
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2013-07-09 19:33:47
这个我知道，我就是不晓得是不是直接紧挨着起始密码加，还有就是怎么考虑移码不移码...

我也觉得这个是关键，有高手可以指点一二
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5楼2013-07-09 22:05:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 学习下 2013-07-10 08:38:53
孙妙妙: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-10 15:16:09
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2013-07-09 19:33:47
这个我知道，我就是不晓得是不是直接紧挨着起始密码加，还有就是怎么考虑移码不移码...

要看一下你插入表达载体的位置，这和你选的酶切位点有关。peT30b是带有his-tag和多个其它标签的。从你选的位点上看，你做的表达蛋白是在N端的his-tag和S tag的融合蛋白。你要考虑的是你的目的基因插入后是否和前面带的这些tag构成移码。这只需要用软件分析一下就行了。
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6楼2013-07-10 01:51:37
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孙妙妙

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by charles08 at 2013-07-09 22:05:49
我也觉得这个是关键，有高手可以指点一二...

我现在又知道了，一点这个移不移码要看你用的载体，然后结合你选的酶切位点来看的，不知道我这样说你能不能理解
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好好做实验！
7楼2013-07-10 15:15:34
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御风（远）

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-12 16:57:06
引用回帖:
7楼: Originally posted by 孙妙妙 at 2013-07-10 15:15:34
我现在又知道了，一点这个移不移码要看你用的载体，然后结合你选的酶切位点来看的，不知道我这样说你能不能理解...

记得要去掉目的片段上的终止子（目的片段和载体各一个终止子，也可以是设计引物时，使用目的片段的终止子，自己在引物上设计组氨酸标签），选择好酶，只要插入片段后能保证标签正常翻译出来就好了。
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8楼2013-07-12 15:54:03
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