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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的问题
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crjtina

银虫 (小有名气)

[求助] PCR的问题

做的PCR也长出克隆，但是测序时出现这样的问题：把我的设计的引物段查找出现是一段正确的，但是比如我的引物设计28个碱基，如果输入20个左右甚至27个时，都会出现两段甚至四段。请问这是什么原因呢
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赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2013-06-24 17:03:07
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回帖置顶 ( 共有1个 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-06-25 12:24:01
crjtina: 金币+5, ★★★很有帮助, 非常感谢，我试图仔细查找各方面原因分析。 2013-06-25 15:07:01
请楼主另外考虑：
1.可能存在靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：（1）整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（2）是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。（3）使用微量移液器时最好用移液器的塑料接头末端处与微量移液器吸杆之间有过滤膜的，如果没有则在塑料接头末端处塞上一小团消毒棉花，以便在吸入液体时阻止塑料接头中的液体由于负压形成气溶胶进入微量移液器吸杆，这是更换了接头仍然会有污染。
2.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体需要重新设计引物。
3.Mg2+ 离子浓度过高，从1.0mmol/L分梯度上调，不能超过10.0mmol/L，每次上升0.05mmol/L。
4.退火温度过低。
5.PCR循环次数过多有关。
6.在PCR反应体系中加入0.01%的白明胶或BSA或Triton X-100,以便增加扩增的专一性。
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6楼2013-06-25 12:04:47
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普通回帖

武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
crjtina: 金币+1, ★有帮助 2013-06-25 08:26:49
可能是引物特异性不高，扩增时候提高温度可能会好点，pcr用来测序要用高保真酶
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2楼2013-06-24 18:01:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-24 21:33:13
crjtina: 金币+2, ★有帮助 2013-06-25 08:26:38
是不是聚合酶的活性太低了，可能没没有保存好，或者放的时间太久了，换种酶试试看；引物是不是可能自身形成了发夹结构，导致只有一部分引物与模板DNA单链 接和了；把引物末端换成G或者C结尾；引物序列中的G和C太少了，低于40%。
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3楼2013-06-24 21:32:55
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-24 18:01:30
可能是引物特异性不高，扩增时候提高温度可能会好点，pcr用来测序要用高保真酶

谢谢啊，温度有95度了，测序是交给公司测的，之前没问题
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赠人玫瑰，手有余香。
4楼2013-06-25 08:23:32
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-24 21:32:55
是不是聚合酶的活性太低了，可能没没有保存好，或者放的时间太久了，换种酶试试看；引物是不是可能自身形成了发夹结构，导致只有一部分引物与模板DNA单链 接和了；把引物末端换成G或者C结尾；引物序列中的G和C太少了 ...

同一批突变的聚合酶，而且一直用的突变的酶是同一种酶，G+C含量大于40%，回头我再检验下引物问题，谢谢啦
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赠人玫瑰，手有余香。
5楼2013-06-25 08:26:22
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