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crjtina

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[求助] PCR的问题

做的PCR也长出克隆，但是测序时出现这样的问题：把我的设计的引物段查找出现是一段正确的，但是比如我的引物设计28个碱基，如果输入20个左右甚至27个时，都会出现两段甚至四段。请问这是什么原因呢

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核酸生物学实验经验

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赠人玫瑰，手有余香。

1楼 2013-06-24 17:03:07

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crjtina

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2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-24 18:01:30
可能是引物特异性不高，扩增时候提高温度可能会好点，pcr用来测序要用高保真酶

谢谢啊，温度有95度了，测序是交给公司测的，之前没问题

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赠人玫瑰，手有余香。

4楼2013-06-25 08:23:32

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3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-24 21:32:55
是不是聚合酶的活性太低了，可能没没有保存好，或者放的时间太久了，换种酶试试看；引物是不是可能自身形成了发夹结构，导致只有一部分引物与模板DNA单链接和了；把引物末端换成G或者C结尾；引物序列中的G和C太少了 ...

同一批突变的聚合酶，而且一直用的突变的酶是同一种酶，G+C含量大于40%，回头我再检验下引物问题，谢谢啦

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赠人玫瑰，手有余香。

5楼2013-06-25 08:26:22

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