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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR的问题
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crjtina

银虫 (小有名气)

[求助] PCR的问题

做的PCR也长出克隆，但是测序时出现这样的问题：把我的设计的引物段查找出现是一段正确的，但是比如我的引物设计28个碱基，如果输入20个左右甚至27个时，都会出现两段甚至四段。请问这是什么原因呢
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赠人玫瑰，手有余香。
1楼 2013-06-24 17:03:07
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-24 21:33:13
crjtina: 金币+2, ★有帮助 2013-06-25 08:26:38
是不是聚合酶的活性太低了，可能没没有保存好，或者放的时间太久了，换种酶试试看；引物是不是可能自身形成了发夹结构，导致只有一部分引物与模板DNA单链 接和了；把引物末端换成G或者C结尾；引物序列中的G和C太少了，低于40%。
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3楼2013-06-24 21:32:55
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
crjtina: 金币+1, ★有帮助 2013-06-25 08:26:49
可能是引物特异性不高，扩增时候提高温度可能会好点，pcr用来测序要用高保真酶
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2楼2013-06-24 18:01:30
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-24 18:01:30
可能是引物特异性不高，扩增时候提高温度可能会好点，pcr用来测序要用高保真酶

谢谢啊，温度有95度了，测序是交给公司测的，之前没问题
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赠人玫瑰，手有余香。
4楼2013-06-25 08:23:32
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crjtina

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-24 21:32:55
是不是聚合酶的活性太低了，可能没没有保存好，或者放的时间太久了，换种酶试试看；引物是不是可能自身形成了发夹结构，导致只有一部分引物与模板DNA单链 接和了；把引物末端换成G或者C结尾；引物序列中的G和C太少了 ...

同一批突变的聚合酶，而且一直用的突变的酶是同一种酶，G+C含量大于40%，回头我再检验下引物问题，谢谢啦
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赠人玫瑰，手有余香。
5楼2013-06-25 08:26:22
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