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leor银虫 (小有名气)
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如何研究小分子抑制蛋白降解途径？
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最近研究一个小分子化合物抑制蛋白降解方面的课题。研究发现该小分子化合物能够促进某个蛋白的表达，但是对转录水平未见有影响，因此，考虑其在蛋白降解方面发挥作用，打算从泛素化和自噬途径考察该小分子化合物对蛋白降解的作用。 现有疑问是，分别用这俩条途径的抑制剂研究蛋白降解了还是用激动剂了？ 谢谢！ |
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-06-17 23:05:55
leor: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢你宝贵的意见！ 2013-06-18 22:22:14
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我没有完全理解你的意思。我大致的理解是你想设计实验来确定一个小分子化合物抑制蛋白降解的作用发生在基因转录水平还是发生在翻译后水平。我理解的对吗？ 如果我的理解没有错误，实验目的就是要揭示：某个小分子与某特定蛋白质的表达的转录水平的特定蛋白质（比如转录因子，但是不限于转录因子）相互作用，还是与参与蛋白质酶水解的蛋白质相互作用？或者该小分子在前两者中都起了作用？ 那么实验研究的关键是：利用Protein-ligand interaction的方法确定目的小分子直接与哪些蛋白质发生了直接的相互作用，然后用与小分子发生了直接的相互作用的蛋白质，再通过Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction的实验方法一步一步向下调取出能够明确地确定某个作用末端的蛋白质到底是转录水平的调控蛋白质还是参与蛋白质酶水解的蛋白质，总之末端作用的蛋白质必须是生物功能已知且明确的。这样实验就成功了。 Protein-ligand interaction，Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction，都有许多成熟的方法（下面我会给出文献），不过我建议还是在活细胞内观测Protein-ligand interaction，Protein-Protein interaction,Protein-DNA interaction比较直接，劳动量也低，效率高；但是体外实验也必须进行，两者相互配合试验进度很快。 我建议使用荧光显微镜，用有机分子染料标记所研究的小分子，待其起作用后用特定波长的荧光照射细胞，大致确定荧光所在的位置；然后对同一批样品可以再用电子显微镜观测有机分子染料标记所研究的小分子的邻近区域有没有在转录的DNA，如果有的话，就优先考虑有机分子染料标记所研究的小分子可能是在转录过程发挥了作用，没有也不一定就能否定，只是不优先考虑有机分子染料标记所研究的小分子可能是在转录过程发挥了作用，但是不能否定这样的可能性；如果可能的话，可以短时间内完全阻断目的蛋白质的mRNA转录过程但是不阻碍翻译，检测目的蛋白质的原有含量是否明显变化；在体外用Pull-down、NMR、阻滞电泳、红外光谱、荧光光谱、电子显微镜观测、能量转移等生物物理学试验方法检测确定机分子染料标记所研究的小分子可能相互作用的蛋白质，酵母双杂交和噬菌体展示就算了（你要是不累，可以尝试酵母双杂交和噬菌体展示  ）；根据体外实验的结果可以对可能的所研究的小分子作用的蛋白质加以有机染料分子标记（不同的蛋白质可以做不同的颜色的有机染料分子标记），然后用荧光显微镜观测小分子的荧光与哪种荧光据合在一起。所有用荧光标记的大分子都可以用量子点标记。（仅供参考！可继续讨论） |
2楼2013-06-17 22:54:44
凌波丽
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我刚刚想到的更简单的办法。你可以将表达的可能的被过表达或者被抑制降解的蛋白质的基因用无细胞的体外表达体系研究，这时就没有了降解方面的干扰；然后再在无细胞体系中加入有关的降解该蛋白质的蛋白酶的基因，或者特定蛋白酶成品，看看两者加入和不加入所要研究的小分子使得可能的被过表达或者被抑制降解的蛋白质表达量的变化。 如果没有无细胞的体外表达体系，就把将表达的可能的被过表达或者被抑制降解的蛋白质的基因克隆到原核的不表达特定蛋白酶的工程细胞中；将降解该蛋白质的蛋白酶的基因也克隆进去到前一种工程细胞中，看看两者加入和不加入所要研究的小分子使得可能的被过表达或者被抑制降解的蛋白质表达量的变化。 意见仅供参考！可以继续讨论. |
3楼2013-06-17 23:05:11
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