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mandywang

铁虫 (正式写手)

[求助] DGGE 垂直电泳 灌胶技术 各位大侠帮帮忙

想确定变性剂的梯度范围,请问DGGE垂直电泳的胶是怎么灌的呢,梯度变化是水平的,那怎么灌呢。看了一个文献貌似说也是用伯乐的小车,一管高,一管低,那梯度是怎么形成的呢。那和我们平时跑得正常的DGGE 也就是水平的DGGE 灌胶不就是用小车灌的吗?
第二个是我每次灌胶拔完梳子之后两边的空挺平的,可是中间的胶孔就会晚上拱形成一个弧度,那在这样的孔里加样跑出来的条带都不直,还有做胶是空附近还总是有气泡。
大家看看我这图,我总感觉条带没分开,是电泳时间影响还是变性剂的梯度范围
我的条件是180v,6h,变性剂30-60%,上样量25ul。
MARKER也会变性,怎么标注呢。
新手问问大家有没有什么小技巧或注意事项。请大家赐教谢谢
DGGE 垂直电泳 灌胶技术 各位大侠帮帮忙
1.JPG
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inging
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mandywang

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 志子 at 2013-05-26 01:59:33
制备平行胶:
平行胶中从上至下变性剂的浓度递增。这种胶适用于分析大量样品。
1) 与制备标准聚丙烯胺凝胶一样制备胶板。
2) 从丙烯酰胺和两种变性剂贮存液中取两份等体积溶液以符合要求的变性剂浓度范围。溶液的 ...

谢谢,麻烦问一下间隔片是什么东西,是仪器带的配件还是可以用什么替代一下呢,还有我们是手动的推车进行灌胶不是梯度生成器,每次灌胶是三通里都有气泡。
你看那个垂直胶是这么灌吧
还有麻烦问一下以我的那个图看,变性剂的梯度应该还可以吧。分离效果主要是什么决定的呢
DGGE 垂直电泳 灌胶技术 各位大侠帮帮忙-1
11.JPG

inging
3楼2013-05-26 16:01:03
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mandywang

铁虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-05-26 16:01:21
首先确定好  变性剂梯度范围正确的话
建议吧 胶浓度 提高一个梯度。比如  通常8%的胶 用来跑300 左右的片段  
提高到10%  或者更高一点, 这样再去摸索电泳时间和电压组合
通常出来的条带会分的比较开  而且形状 ...

我的片段有点大450左右,那提高胶的浓度可行吗?我也不懂,你别建议,上面那哥们说丙烯酰胺的浓度取决于DNA 片段的大小,对于DNA 片段大小为≥300bp 的丙烯酰胺的浓度为6%,
而长度<300bp 的DNA 片段,丙烯酰胺的浓度为12%。
为什么我两边的条带不弯反而中间的弯呢。谢谢,亲,就剩5个了别嫌少哈
inging
6楼2013-05-26 16:07:14
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mandywang

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-05-26 16:03:07
哦 对了
电泳时候 电压不宜太高,我感觉有些文献里面说 一百八,六个小时
尝试下 120-160 之间  时间 相应延长,乘积 大约1100 左右即可。

我也试过160v,390min,总感觉时间太长条带弯,这个条带弯是我做胶的问题尼还是时间太长呀,梳子拔下来总觉得胶孔弯是不凝胶时间不够长呢
inging
7楼2013-05-26 16:21:56
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mandywang

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-05-26 16:31:19
胶 孔 弯?
是 两个孔之见的起隔档作用的那部分凝胶整体弯了么。。
这个我也遇到过 ,你可以试试 适当提高聚丙烯酰胺浓度   凝胶时间放长些。
梳子 一定要干净  取出来的时候 仔细一点。
另外 我没遇到过 时 ...

好滴谢谢,我明天试试。我的是拔完梳子胶孔底部不是平的而是向上形成一个拱的弧度。
inging
9楼2013-05-26 21:27:29
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mandywang

铁虫 (正式写手)

木有呀
inging
14楼2013-11-23 16:49:48
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