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chin_jl

铜虫 (小有名气)

[求助] 求大神帮忙“切尾”。。

我提的是湖底泥巴里的总DNA,但是有拖带现象,,而且很严重,希望大神来帮忙。。看看是什么问题。
  实验方法:1)取2g土样于7mL离心管中加入2mL裂解缓冲液(100mL of 100mM Tris-HCl[pH 8.0],100mM EDTA[pH8.0],1.5M NaCl)。
2)加入2g酸洗石英沙后振荡2min,再加入0.2mL SDS(20%)继续振荡5sec继而65°C温浴1h。
3)6000r离心10min,收集上清于另一新的离心管,土壤颗粒重新悬浮于2mL裂解缓冲液65°C温浴10min,6000r离心10min。混合两次离心的上清,加入一半体积的含NaCl(1.6M)的聚乙二醇(30%),室温静置2h。
4)10000r离心20min,弃上清,粗制核酸悬浮于0.4mL TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)。加KAc(3M)至最终浓度为0.5M,冰浴5min。
5)4°C 13000r离心30min。水相中先加入等体积的苯酚:氯仿,13000r离心10分钟,再加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇,13000r离心10分钟。水相中加入0.6倍体积的异丙醇,室温静置2h。
5)13000r离心30min DNA沉淀,用70%乙醇13000r离心10分钟两次。沉淀重新悬浮于20μL TE溶液中。
求大神帮忙“切尾”。。
拖带问题.png
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
chin_jl: 金币+14, ★★★很有帮助 2013-05-25 10:45:26
引用回帖:
3楼: Originally posted by chin_jl at 2013-05-23 22:03:57
先谢谢了,TE里已经加了RNase,,那DNA碎片应该怎么处理呢?...

看你的后续试验要求了,如果DNA碎片不影响后续结果就不处理,如果影响结果,最简单的处理方法就是切胶回收你的目的条带。
4楼2013-05-24 09:12:42
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
chin_jl(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-23 15:34:42
chin_jl: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-05-23 22:03:21
你这电泳图不是拖尾现象,拖尾应该是靠近胶点样孔位置才对,现在是在目的条带的前方有荧光,说明那些条带比目的条带更小,很可能是RNA污染或者DNA片段断裂导致。
2楼2013-05-23 15:20:34
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chin_jl

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-05-23 15:20:34
你这电泳图不是拖尾现象,拖尾应该是靠近胶点样孔位置才对,现在是在目的条带的前方有荧光,说明那些条带比目的条带更小,很可能是RNA污染或者DNA片段断裂导致。

先谢谢了,TE里已经加了RNase,,那DNA碎片应该怎么处理呢?
3楼2013-05-23 22:03:57
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chin_jl

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-05-24 09:12:42
看你的后续试验要求了,如果DNA碎片不影响后续结果就不处理,如果影响结果,最简单的处理方法就是切胶回收你的目的条带。...

哟西。。。16srDNA已经P出来了。。。那就是不用处理了。嘿嘿。。谢谢
5楼2013-05-25 10:45:17
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