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小妞116

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题已有2人参与

从细胞中提取的RNA,逆转录后PCR,没有转染质粒的细胞也总是可以扩增出我的目的条带,这是什么原因?
还有就是通过DNase1 可以去除基因组DNA吗?去除后可以直接逆转录吗,还是得纯化后逆转录,那TAKARA的说明书实在是太复杂了。貌似第三步去除了基因组DNA后,第四步又开始了纯化,实在是没明白,求助大侠帮忙啊!!!
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 小妞116 at 2013-05-20 17:52:00
可是那怎么验证啊,琼脂糖凝胶?...

你是要做qPCR的话,肯定有个reference gene吧。给这个gene设计特异引物,大概400-500bp的product size。然后做个regular PCR,多加点儿cycle,如38-40,再泡个胶,看有无条带。如果有这那个位置有条带,肯定是以残存的gDNA为模板扩出来的。
向钱看,向厚赚
11楼2014-01-20 01:19:12
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-20 16:11:57
楼主的试剂有污染, 或者取样的时候样品交叉污染, 这是首要问题.
2楼2013-05-16 17:55:47
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sweetbobo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-20 16:12:20
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:15:10
不知道你的RNA是不是做realtime PCR,一般情况是,为了防止基因组被扩增,第一要去除RNA中的DNA,就是你正常抽出RNA,加入DNaseI和RNA抑制剂,同时处理后,就再重新加入RNAiso再抽提一轮就可以;第二在设计引物的时候要跨内含子设计,该内含子长度一般要超过1Kb,不然也会有非特异性扩增。不知道你是不是这样的
3楼2013-05-16 20:14:50
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飞天36

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小妞116: 金币+2, 有帮助 2013-05-20 09:20:16
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 75%酒精洗涤的目的是去盐,DNA是去除不了的 2013-05-20 16:13:08
你传染的细胞是否表达,你要的目的基因,没有的话,你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤,去除DNA
生活很多不如意,现在想给变
4楼2013-05-20 08:43:56
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