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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 助啊，为什么我的microrRNA提不出来啊？？？为什么啊？
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dmtxbb

金虫 (正式写手)

[求助] 助啊，为什么我的microrRNA提不出来啊？？？为什么啊？

1. 液氮研磨后加入Trizol提取，氯仿抽提，异丙醇沉淀，酒精洗脱。

2. RNA跑胶检测无降解无蛋白质污染

3. 反转录16微RNA+1.6微反转录引物

反转录体系：M-MLV 1微

Buffer 5微

DNTP 1.3微

RNASE 0.7微

反转录程序：16度 30min

(30度 30s 42度 30s 50度 1s )60个循环

70度 5min

miR952 序列 AACGAGGATCCATTGGAG

茎环引物5'gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacCTCCAA 3'

正向引物GCCGCAACGAGGATCCA

通用反向引物gtgcagggtccgaggt

这是我的体系，大家帮我看看为什么扩增不出来啊？我是提了rna直接扩增的。提了好多次都扩增不出来，大家帮我看看是哪里出问题了啊？？？谢谢啊！
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1楼 2013-05-14 15:49:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yangyufen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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dmtxbb: 金币+5, ★★★很有帮助, 能不能再具体说一下么，谢谢谢谢 2013-05-14 18:18:41
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:10:01
这种提取方法提取RNA纯度不够吧，然后扩增程序温度怎么都这么低的说？
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2楼2013-05-14 16:47:54
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dmtxbb: 金币+5, ★★★很有帮助, 能不能再具体说一下呢？谢谢谢谢 2013-05-14 18:18:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:10:12
没有听说过用异丙醇沉淀microRNA的，而且microRNA跑胶也看不到啊，所以不确定你提出来的是microRNA
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3楼2013-05-14 17:04:42
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普通回帖

dmtxbb

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangyufen at 2013-05-14 16:47:54
这种提取方法提取RNA纯度不够吧，然后扩增程序温度怎么都这么低的说？

那用什么方法啊，polya尾法么？
温度应该多少啊？谢谢谢谢啊
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4楼2013-05-14 18:16:08
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dmtxbb

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-05-14 17:04:42
没有听说过用异丙醇沉淀microRNA的，而且microRNA跑胶也看不到啊，所以不确定你提出来的是microRNA

不会吧。。。。难道我做的都是错的。。。我用异丙醇沉淀的是rna啊。。总rna啊~难道不对么？我扩出来过，难道不是microrna么？？大侠都是用什么检测的啊？
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5楼2013-05-14 18:17:24
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9号逐梦客

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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dmtxbb: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-14 19:00:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:10:31
我以前做过，普通提RNA的方法也是可以提的，就是逆转录要注意改变了。还有就是 可以用现有的microRNA提取试剂盒来纯化，比如ABI公司的。你可以找找，这种东西应该有很多了。
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为了梦想不断坚持在路上
6楼2013-05-14 18:46:59
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dmtxbb

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 9号逐梦客 at 2013-05-14 18:46:59
我以前做过，普通提RNA的方法也是可以提的，就是逆转录要注意改变了。还有就是 可以用现有的microRNA提取试剂盒来纯化，比如ABI公司的。你可以找找，这种东西应该有很多了。

我逆转录的时候注意了，是用特异的引物去扩增的。。不知道这样行么？还有你说的试剂盒是全套都是试剂盒？还是提出rna来然后试剂盒纯化一下？谢谢
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7楼2013-05-14 19:00:48
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9号逐梦客

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dmtxbb(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:10:47
dmtxbb: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，我试试 2013-05-22 14:28:41
引用回帖:
7楼: Originally posted by dmtxbb at 2013-05-14 19:00:48
我逆转录的时候注意了，是用特异的引物去扩增的。。不知道这样行么？还有你说的试剂盒是全套都是试剂盒？还是提出rna来然后试剂盒纯化一下？谢谢...

好像是microRNA的提取和纯化在一起的，你可以去ABI公司查查看，会有的，具体我不是很清楚，我当时做的时候没有用那个试剂盒。
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为了梦想不断坚持在路上
8楼2013-05-14 23:37:59
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dmtxbb: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢，我试试 2013-05-22 14:28:27
异丙醇沉淀是没有选择性的，DNA和RNA都可以沉淀，microRNA提取用trizol处理后，一般直接用吸附柱吸附，microRNA的量是很少的，而且又很小才20NT左右，很怀疑异丙醇能不能沉淀这么小的RNA，我使用过国内的吸附柱和Qiagen的，还是国外的好一点。
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9楼2013-05-15 08:50:32
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植物园园长

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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dmtxbb: 金币+3, ★有帮助, 试剂盒有点小贵呢 2013-05-22 14:27:38
用天根的microRNA提取，检测试剂盒吧，很多人都在用，也发了很多大文章。
下周天根将组织microRNA研讨会，感兴趣的可报名参加～
http://www.tiangen.com/?newsShow/t/159/id/50.html
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在路上～～Marketing!
10楼2013-05-15 08:53:11
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