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dmtxbb

金虫 (正式写手)

[求助] 助啊，为什么我的microrRNA提不出来啊？？？为什么啊？

1. 液氮研磨后加入Trizol提取，氯仿抽提，异丙醇沉淀，酒精洗脱。

2. RNA跑胶检测无降解无蛋白质污染

3. 反转录16微RNA+1.6微反转录引物

反转录体系：M-MLV 1微

Buffer 5微

DNTP 1.3微

RNASE 0.7微

反转录程序：16度 30min

(30度 30s 42度 30s 50度 1s )60个循环

70度 5min

miR952 序列 AACGAGGATCCATTGGAG

茎环引物5'gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacCTCCAA 3'

正向引物GCCGCAACGAGGATCCA

通用反向引物gtgcagggtccgaggt

这是我的体系，大家帮我看看为什么扩增不出来啊？我是提了rna直接扩增的。提了好多次都扩增不出来，大家帮我看看是哪里出问题了啊？？？谢谢啊！
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1楼 2013-05-14 15:49:19
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dmtxbb: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢，我试试 2013-05-22 14:28:27
异丙醇沉淀是没有选择性的，DNA和RNA都可以沉淀，microRNA提取用trizol处理后，一般直接用吸附柱吸附，microRNA的量是很少的，而且又很小才20NT左右，很怀疑异丙醇能不能沉淀这么小的RNA，我使用过国内的吸附柱和Qiagen的，还是国外的好一点。
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9楼2013-05-15 08:50:32
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yangyufen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dmtxbb: 金币+5, ★★★很有帮助, 能不能再具体说一下么，谢谢谢谢 2013-05-14 18:18:41
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:10:01
这种提取方法提取RNA纯度不够吧，然后扩增程序温度怎么都这么低的说？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-05-14 16:47:54
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dmtxbb: 金币+5, ★★★很有帮助, 能不能再具体说一下呢？谢谢谢谢 2013-05-14 18:18:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-15 03:10:12
没有听说过用异丙醇沉淀microRNA的，而且microRNA跑胶也看不到啊，所以不确定你提出来的是microRNA
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-05-14 17:04:42
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dmtxbb

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangyufen at 2013-05-14 16:47:54
这种提取方法提取RNA纯度不够吧，然后扩增程序温度怎么都这么低的说？

那用什么方法啊，polya尾法么？
温度应该多少啊？谢谢谢谢啊
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4楼2013-05-14 18:16:08
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