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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)

[求助] southern blotting 实验问题求助!

探针的标记 是什么时候标记呢?我已经制备完探针了 保存在-20,没有加marker,这个怎么办?可以直接往里加吗?

酶切没有条带 DNA的浓度是500ng/ml 我加了15ul左右到体系里 体系是40ul 可是酶切之后什么都没有 没有带 点样孔里什么也没有  我用的是hind III  这是为什么呢?是DNA降解了吗?

southern 的图片 什么样的算是成功的呐?
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gyesang

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 10:29:39
“酶切没有条带 DNA的浓度是500ng/ml 我加了15ul左右到体系里 体系是40ul 可是酶切之后什么都没有 没有带 点样孔里什么也没有”  
这种情况肯定是你的DNA在酶切过程被降解了,最有可能的是你用的水出问题了,检查一下你的水,用个不同来源的水试试。

不知道你的探针是用什么方法表的,同位素还是DIG?

探针里面加Marker?不是很懂,为什么要加marker?我做的时候,是从来没有加过的
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-04 19:21:19
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wxf8470

木虫 (小有名气)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 10:29:51
先做预酶切,证明你的DNA没问题,酶切没问题,之后再转膜;转好的膜在4度冰箱放一两个星期是可以的,我们曾放过一个月的还能用。
之后再标记探针,忘了加Marker最好重新标记,否则大小分不清图是不能用的。
3楼2013-05-04 23:45:56
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-04 19:21:19
“酶切没有条带 DNA的浓度是500ng/ml 我加了15ul左右到体系里 体系是40ul 可是酶切之后什么都没有 没有带 点样孔里什么也没有”  
这种情况肯定是你的DNA在酶切过程被降解了,最有可能的是你用的水出问题了,检查一 ...

我和同学一起做的 她的就有条带我的就没有 我们用的一样的水 应该不是水的问题吧 我的探针是DIG标记 我们需要加hind III maeker 但是我在制备探针的时候忘记加了
4楼2013-05-06 17:05:01
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wxf8470 at 2013-05-04 23:45:56
先做预酶切,证明你的DNA没问题,酶切没问题,之后再转膜;转好的膜在4度冰箱放一两个星期是可以的,我们曾放过一个月的还能用。
之后再标记探针,忘了加Marker最好重新标记,否则大小分不清图是不能用的。

我的酶切电泳没有条带 什么都没有 但是杂交之后 阳性却有条带 但是转化的没有条带   必须加marker吗 我i在杂交之前有个变性探针的时候加可以吗
5楼2013-05-06 17:06:50
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wxf8470

木虫 (小有名气)


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:17:33
Marker是用来指示大小的,同时加是因为想标记目的基因的探针时同时标记Marker, 当然也可以单独标记。事实上不加效果会更好,因为Marker也是标记了的dna, 会提高背景。
6楼2013-05-07 02:33:36
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wxf8470 at 2013-05-07 02:33:36
Marker是用来指示大小的,同时加是因为想标记目的基因的探针时同时标记Marker, 当然也可以单独标记。事实上不加效果会更好,因为Marker也是标记了的dna, 会提高背景。

我还是不太懂为什么要加marker  为什么分开加也可以?
7楼2013-05-07 10:56:40
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wxf8470

木虫 (小有名气)


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:17:36
胶上有Marker DNA, 容易检测,紫外灯下可见;转到膜上后就不易检测了。这时需要制备Marker DNA 特异的探针。可以跟目的基因探针放一起同时制备,也可以单独制备杂交时再跟目的基因探针同时加。
8楼2013-05-07 20:59:54
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稻稻

铜虫 (著名写手)


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:17:41
是不是胶孔下面透了,都漏出去了
做一个不动声色的人,不准情绪化,不准回头看。
9楼2013-09-13 21:32:01
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请问生物化学

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Grace葡萄 at 2013-05-06 17:06:50
我的酶切电泳没有条带 什么都没有 但是杂交之后 阳性却有条带 但是转化的没有条带   必须加marker吗 我i在杂交之前有个变性探针的时候加可以吗...

你好,我想问一下,你的探针和DNA的比例是多少呀。
10楼2017-11-18 11:42:16
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