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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » southern blotting 实验问题求助！
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)

[求助] southern blotting 实验问题求助！

探针的标记 是什么时候标记呢？我已经制备完探针了 保存在-20，没有加marker，这个怎么办？可以直接往里加吗？

酶切没有条带 DNA的浓度是500ng/ml 我加了15ul左右到体系里 体系是40ul 可是酶切之后什么都没有 没有带 点样孔里什么也没有  我用的是hind III  这是为什么呢？是DNA降解了吗？

southern 的图片 什么样的算是成功的呐？
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1楼 2013-05-04 17:29:16
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 10:29:39
“酶切没有条带 DNA的浓度是500ng/ml 我加了15ul左右到体系里 体系是40ul 可是酶切之后什么都没有 没有带 点样孔里什么也没有”  
这种情况肯定是你的DNA在酶切过程被降解了，最有可能的是你用的水出问题了，检查一下你的水，用个不同来源的水试试。

不知道你的探针是用什么方法表的，同位素还是DIG？

探针里面加Marker？不是很懂，为什么要加marker？我做的时候，是从来没有加过的
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2楼2013-05-04 19:21:19
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wxf8470

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 10:29:51
先做预酶切，证明你的DNA没问题，酶切没问题，之后再转膜；转好的膜在4度冰箱放一两个星期是可以的，我们曾放过一个月的还能用。
之后再标记探针，忘了加Marker最好重新标记，否则大小分不清图是不能用的。
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3楼2013-05-04 23:45:56
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-04 19:21:19
“酶切没有条带 DNA的浓度是500ng/ml 我加了15ul左右到体系里 体系是40ul 可是酶切之后什么都没有 没有带 点样孔里什么也没有”  
这种情况肯定是你的DNA在酶切过程被降解了，最有可能的是你用的水出问题了，检查一 ...

我和同学一起做的 她的就有条带我的就没有 我们用的一样的水 应该不是水的问题吧 我的探针是DIG标记 我们需要加hind III maeker 但是我在制备探针的时候忘记加了
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4楼2013-05-06 17:05:01
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wxf8470 at 2013-05-04 23:45:56
先做预酶切，证明你的DNA没问题，酶切没问题，之后再转膜；转好的膜在4度冰箱放一两个星期是可以的，我们曾放过一个月的还能用。
之后再标记探针，忘了加Marker最好重新标记，否则大小分不清图是不能用的。

我的酶切电泳没有条带 什么都没有 但是杂交之后 阳性却有条带 但是转化的没有条带   必须加marker吗 我i在杂交之前有个变性探针的时候加可以吗
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5楼2013-05-06 17:06:50
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wxf8470

木虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:17:33
Marker是用来指示大小的，同时加是因为想标记目的基因的探针时同时标记Marker, 当然也可以单独标记。事实上不加效果会更好，因为Marker也是标记了的dna, 会提高背景。
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6楼2013-05-07 02:33:36
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Grace葡萄

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wxf8470 at 2013-05-07 02:33:36
Marker是用来指示大小的，同时加是因为想标记目的基因的探针时同时标记Marker, 当然也可以单独标记。事实上不加效果会更好，因为Marker也是标记了的dna, 会提高背景。

我还是不太懂为什么要加marker  为什么分开加也可以？
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7楼2013-05-07 10:56:40
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wxf8470

木虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:17:36
胶上有Marker DNA, 容易检测，紫外灯下可见；转到膜上后就不易检测了。这时需要制备Marker DNA 特异的探针。可以跟目的基因探针放一起同时制备，也可以单独制备杂交时再跟目的基因探针同时加。
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8楼2013-05-07 20:59:54
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稻稻

铜虫 (著名写手)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:17:41
是不是胶孔下面透了，都漏出去了
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做一个不动声色的人，不准情绪化，不准回头看。
9楼2013-09-13 21:32:01
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请问生物化学

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Grace葡萄 at 2013-05-06 17:06:50
我的酶切电泳没有条带 什么都没有 但是杂交之后 阳性却有条带 但是转化的没有条带   必须加marker吗 我i在杂交之前有个变性探针的时候加可以吗...

你好，我想问一下，你的探针和DNA的比例是多少呀。
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10楼2017-11-18 11:42:16
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