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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)

[求助] 关于稀释平板计数法的疑问

1.我用的浇注法，应该24h计数还是48h计数？
2.长了24h后培养基表面的菌落很明显，但是培养基内部的菌就是一个小点点，很难看到，稀释倍数低的平板像是10倍100倍1000倍几乎全部都是一个点一个点大片大片的挺均匀根本看不清。这时该怎么计数呢？稀释度高的培养基内部也有一些点点，是表面和内部的都记上去吗？
3.我一共做了7个梯度的十倍稀释。原菌液倒平板之前的OD是1.13了，稀释十倍之后变成0.13，稀释100倍是0.01，1000居然变成0了，后面的稀释度也是0左右。那这么看来菌液里的菌很少很少很少了，可是为什么平板计数后后面OD值是0的菌长出来的菌落还挺多啊，不数那些点点就差不多在30-300之间，数了差不多1000以上了。。。。
不懂怎么计数。我是想做一个CFU与OD之间关系的曲线来着。

是不是该等平板培养一段时间的同时要将相应稀释倍数的菌同等条件培养呢？是不是菌在平板里扩大培养了所以之前测的OD值是不对的？

[ Last edited by 襄阳蓉儿 on 2013-4-28 at 11:46 ]
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少壮不努力，长大pcr
1楼 2013-04-28 11:28:10
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bingge880306

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+5, 鼓励交流应助！ 2013-05-03 20:31:36
关于第一个问题，24小时应该就可以了，时间太长菌落数就难以确定了，后期就都长在一起了，而且后期也有抑制作用了
第二个问题其实都做几个平行试验就可以了，不用计数稀释度低的吧，只要把稀释到最后的菌落数合适的那个梯度多做几个平行试验不就可以倒推回原菌落数吗
第三个问题可能你的操作不当，在空气中就染菌了，是在酒精灯范围内操作的吗？应在酒精的火焰周围15厘米的范围内操作才可以保证不染菌。
希望能帮到你啊
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2楼2013-04-28 13:59:48
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zjm104273

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+5, good！ 2013-05-03 20:31:15
1、你培养的是什么微生物?计数一般选择对数生长期，例如大肠杆菌通常24小时左右就可以进行菌落计数了。
2. 菌落计数应该是所有菌落均做统计，如果你觉得通过浇注法内部与表面有干扰，可考虑通过涂布的方法计数。计数时不是平板上长多少就计多少的，菌液浓度越大，几个细胞长出一个菌落，或者甚至菌落连成菌苔，根本没法计数，即使数出来也不准确，我们通常对于一个样品会选择几个不同的稀释度，涂平板以后，选择生长菌落数在30-200左右的平板计数，然后再乘以稀释倍数得到原始样品的浓度，菌落数太多计数值偏小，菌落数太少随机性太大，很不准确。
3、你讨论浓度和OD值关系的时应选择一定范围，不是从0开始，大概10的5次方到8次方左右吧，浓度低的话OD值肯定趋近与0的，浓度太高的话两者关系不再近乎线性。。
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6楼2013-04-29 19:01:16
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 菜鸟一点红 at 2013-05-02 10:37:26
测0D值，你是用的无菌水稀释还是培养基稀释的，我最近也在做类似试验，测OD值得，用无菌水作为对照是不是不合理啊，还是用培养基呢

我使用培养基稀释的，多多交流哈
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少壮不努力，长大pcr
11楼2013-05-02 11:08:19
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普通回帖

襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bingge880306 at 2013-04-28 13:59:48
关于第一个问题，24小时应该就可以了，时间太长菌落数就难以确定了，后期就都长在一起了，而且后期也有抑制作用了
第二个问题其实都做几个平行试验就可以了，不用计数稀释度低的吧，只要把稀释到最后的菌落数合适的 ...

谢谢你
2.倒推的意思是，假如说我的第五个十倍稀释是50个菌落，那倒退回第四个十倍稀释就是500个？
3.你的意思是说培养基内部的小点点是杂菌？不会吧，因为高浓度菌液长出来的是很密密麻麻的小点点，我是倾注平板不是涂布平板所以培养基内部也会有菌的吧？
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少壮不努力，长大pcr
3楼2013-04-28 14:30:57
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bingge880306

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

2.对呀
3.换个培养基试试呢
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4楼2013-04-28 19:40:30
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bingge880306

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

那是不是因为菌的兼性厌氧和好氧的问题呢
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5楼2013-04-28 19:55:03
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zjm104273 at 2013-04-29 19:01:16
1、你培养的是什么微生物?计数一般选择对数生长期，例如大肠杆菌通常24小时左右就可以进行菌落计数了。
2. 菌落计数应该是所有菌落均做统计，如果你觉得通过浇注法内部与表面有干扰，可考虑通过涂布的方法计数。计 ...

可是我纠结的是我每次做实验之前都要确保CFU在10的6次方，要是每次都这么数一次，那就是把前一天铺平板的菌液倒平板之后保存在4度吗？然后等第二天长出来再计数选择哪个稀释度的菌液吗？
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少壮不努力，长大pcr
7楼2013-05-02 09:58:49
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bingge880306 at 2013-04-28 19:55:03
那是不是因为菌的兼性厌氧和好氧的问题呢

我觉得是的，但是不知道该不该计算进去
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少壮不努力，长大pcr
8楼2013-05-02 09:59:24
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zjm104273 at 2013-04-29 19:01:16
1、你培养的是什么微生物?计数一般选择对数生长期，例如大肠杆菌通常24小时左右就可以进行菌落计数了。
2. 菌落计数应该是所有菌落均做统计，如果你觉得通过浇注法内部与表面有干扰，可考虑通过涂布的方法计数。计 ...

2.我稀释第7个10倍数出来的是100个菌落，每个平板接种的是0.2ml那计算公式应该是100*5*10（7次方）=5*10（9次方），那就是原菌液是这个浓度的是吧，那我需要1*10（6次方），这个是不是把我的原菌液稀释5000倍，是这个意思吗？
3.我的第7个10倍稀释出来的输出来的菌落都那么多，OD还是0这没法儿在稀释了吧？
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少壮不努力，长大pcr
9楼2013-05-02 10:23:23
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菜鸟一点红

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

测0D值，你是用的无菌水稀释还是培养基稀释的，我最近也在做类似试验，测OD值得，用无菌水作为对照是不是不合理啊，还是用培养基呢
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10楼2013-05-02 10:37:26
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