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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了
汕头大学海洋科学接受调剂
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-26 23:49:51
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl ...

你好，我的引物是参照文献(克隆的是灵芝的漆酶基因)上的，我要克隆Inonotus obliquus的漆酶laccase基因；引物的设计都是根据真菌漆酶的四个保守氨基酸结构域设计的，应该不能因为太特异而不能扩增我的菌吧。
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11楼2013-04-27 17:16:14
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by sanmiao at 2013-04-27 09:44:39
高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu都可以！效果都很好:

还有，2ul的模板，是不是有点多啊，有的时候模板浓度需要很少就可以了，多了里面有抑制成分，反而P不出来；一般5-10ng就可以了 ...

我用CTAB法提取的菌丝体DNA，提出后溶于20μL的双蒸水，浓度会很大么？
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12楼2013-04-27 17:53:12
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-26 23:49:51
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl ...

还有，我用的模板是DNA，关系大么
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13楼2013-04-27 17:53:40
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
啊虫木(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:03:51
简并引物，我建议合成多条。还有，引物之间的产物，如果是RACE实验的话，我建议不要太大。有时候太贪了不好。没有产物，绝大多数是引物问题。再合成几条吧。
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14楼2013-04-28 10:52:21
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-04-28 10:52:21
简并引物，我建议合成多条。还有，引物之间的产物，如果是RACE实验的话，我建议不要太大。有时候太贪了不好。没有产物，绝大多数是引物问题。再合成几条吧。

嗯，谢谢你。
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15楼2013-04-29 11:45:59
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失意女孩

新虫 (初入文坛)
★
啊虫木(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-06 12:28:33
我最近在做霉菌基因的简并，已经简并出三个基因，我感觉还是引物最重要吧，我的是每次很多条带很密集都不知目的条带是哪一条。
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16楼2013-05-05 21:01:57
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意孤城_

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-26 23:49:51
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl ...

dNTP是不是少了点？
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17楼2013-05-06 11:36:39
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-06 11:36:39
dNTP是不是少了点？...

唔，好像是
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18楼2013-05-10 10:44:30
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 失意女孩 at 2013-05-05 21:01:57
我最近在做霉菌基因的简并，已经简并出三个基因，我感觉还是引物最重要吧，我的是每次很多条带很密集都不知目的条带是哪一条。

嗯，这在努力设计引物，谢谢你
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19楼2013-05-10 10:45:07
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-26 23:49:51
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl ...

朋友你好！看到你在的有关简并引物设计的帖子，想请教一下：我用codehop设计的几对引物为什么总是扩增不出来目的条带呢？我做的是普通pCR，用的酶是takara LA酶。你是怎么做的？具体怎么操作？谢谢！
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日拱一卒，功不唐捐
20楼2014-01-09 18:11:16
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