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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 猪粪中细菌总DNA的提取
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zhoujlhn

铜虫 (初入文坛)

[求助] 猪粪中细菌总DNA的提取

小弟最近在提取猪粪中细菌的总DNA，老板说要自己摸索方法，没有考虑过用试剂盒，但是怎么提都没有提出来，请教各位前辈，有谁做过这一块的，请你给小弟我支支招！先谢谢了！下面是我用的方法：
样品的前处理：
称取0.3g粪样放入2ml离心管中，加入1.5mlPBS（ph8.0）溶液，旋涡振荡混匀，4℃，800rpm离心10min;吸上清液转入另一干净2ml离心管中，4℃， 1000rpm离心 10min;再将上清液转入另一干净 2ml离心管中，重复此步骤，直至离心后上清液有菌体浑浊感为止；最后将上清液4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清，收集沉淀。将沉淀用适量丙酮洗涤，并转入到 1.5ml离心管中，旋涡振荡混匀， 4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清。用丙酮洗涤两次后，收集沉淀自然干燥或吹干
细胞裂解及DNA抽提：
1、        经过前处理后的样品，加600μL TE，20μL溶菌酶 (100mg/ml)，轻轻颠倒混匀，于37℃放置 30min;
2、        加入15μL蛋白酶K，500μL裂解液，55℃温浴3-4h，每 20min轻轻颠倒混匀一次;
3、        然后加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻混成乳浊液， 4℃，13000rpm离心10min，小心吸上相至空管中;
4、        再加等体积的氯仿/异戊醇(24:l)轻轻颠倒混匀，13000rpm离心 10min，小心吸上相至空管中;加等体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜;
5、        将DNA样品取出，13000rpm离心20min，倒去异丙醇，用80%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心 10min，弃上清，并将异丙醇吹干;
6、        将DNA溶于60μL TE，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，于-70℃保存.
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总DNA提取

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一个人的奋斗！！！
1楼 2013-04-11 19:57:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

枫林雨

金虫 (正式写手)

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★
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zhang8826857: 金币+1, 手机回复，不容易 2013-04-13 22:22:04
要进行预备处理，去除色素，抑制性物质等。用PBS溶液处理等，你可以参考下土壤总DNA的提取预处理。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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喜欢跑步、羽毛球还有暖心的文字。
3楼2013-04-11 22:59:29
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普通回帖

馨沁

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
反复冻融一下试试吧
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2楼2013-04-11 21:31:08
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zhoujlhn

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 馨沁 at 2013-04-11 21:31:08
反复冻融一下试试吧

按照这个方法RNA到提取出了好多，DNA没有出来
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一个人的奋斗！！！
4楼2013-04-12 09:17:53
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zhoujlhn

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 枫林雨 at 2013-04-11 22:59:29
要进行预备处理，去除色素，抑制性物质等。用PBS溶液处理等，你可以参考下土壤总DNA的提取预处理。

我用PBS洗了，丙酮也洗了，就是提取不出来，只能见到RNA，DNA没有看到
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一个人的奋斗！！！
5楼2013-04-12 09:18:45
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枫林雨

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的量多少，试着减少量，或者增加量。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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喜欢跑步、羽毛球还有暖心的文字。
6楼2013-04-12 10:57:06
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yaoyl0679

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖 2013-04-13 22:22:12
前面不要这么处理，只要用pBS洗涤，离心8000rpm，把上清去掉，留沉淀，洗三次后用沉淀提DNA，肯定提出来
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7楼2013-04-12 16:50:57
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhoujlhn at 2013-04-12 09:18:45
我用PBS洗了，丙酮也洗了，就是提取不出来，只能见到RNA，DNA没有看到...

去除RNA在第二补加RNA酶，DNA少我建议你放大你的体系，你出发的样本量就太少了
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相信自己
8楼2013-04-12 17:22:00
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖 2013-04-13 22:22:17
前阵子看了资料，推荐用全基因组扩增试剂盒，自己先搜索资料看看，然后没钱就参考着买各种试剂回来做，基本都有国产的。
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为什么
9楼2013-04-12 21:27:02
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likewind_z

金虫 (小有名气)
既然结果里提到RNA很多，为什么步骤里没有RNA酶的处理？
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10楼2013-04-13 16:29:54
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