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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一步RT-PRC后样品卡在凝胶孔了
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 一步RT-PRC后样品卡在凝胶孔了

提细胞总RNA，跑出三条带了，第一条比第二条亮一倍多。
然后RT-PCR用特异性引物做，阳性对照，阴性对照，实验组都没有东西，marker出来了。那三组凝胶孔发亮。
我加的模板是3微，由于没机会测浓度和OD260/280，第一次做的时候加了5微，也是一样的效果。
由于引物除了互补区外还加了酶切位点和保护碱基，就逆转录过后5个循环是不算酶切位点的退火温度，剩下做了25个循环是按照全长引物算的，大概提高了7度。
由于内参也没有做出来，我很是抑郁。
想知道，是不是就是因为我没有测纯度和浓度造成的。但是我跑总RNA的时候条带除了28s的两侧有一点拖尾，另外两条都很好，亮度也不错。

PS，如果我引物不是完全互补的，是不是会造成PCR的难度捏。那我是不是应该用两步RTPCR比较好？

拜托大神们了！

rtpcr.jpg



总RNA.jpg
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1楼 2013-04-06 18:16:16
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emosgaogao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-07 11:52:25
楼主PCR后的样品可能是蛋白质污染，目的片段的丰度低，而且从总RNA的电泳结果看28s片段有拖尾，所以还是建议楼主试试2步法RT-PCR看。
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忍得住诱惑，耐得住寂寞
2楼2013-04-07 00:04:14
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-07 21:46:33
对呀。。就是做完PCR之后拿出来，上面是浅色近乎于无色的，下面是深蓝色的。说明书说直接上洋，我就用吸头吹匀以后上，然后marker的溴酚蓝会往前跑，样品的不会。。。
用过南京凯基的一步氏RTPCR么...

感觉是试剂有问题.正常情况下溴酚蓝不应沉淀。
lz做个空白对照，就是把RNA换成水，做一次RT-PCR。如果溴酚蓝还是沉淀，保留该反应物，然后找卖你们试剂的人索赔。
但如果空白对照正常，就是你的RNA含有杂质了。
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15楼2013-04-08 22:22:10
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-07 11:52:35
检查一下RNA有没有降解了或RT PCR产物，多试几个手头现有的RT-PCR阳性参照。
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3楼2013-04-07 01:08:04
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2013-04-07 01:08:04
检查一下RNA有没有降解了或RT PCR产物，多试几个手头现有的RT-PCR阳性参照。

那个RT-PCR的时候就已经加好了溴酚蓝了,然后放进机器里面再拿出来蓝色就会再底部沉淀,这样有没有影响呢,我上样品的时候要用枪吹匀才行
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4楼2013-04-07 10:13:19
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by emosgaogao at 2013-04-07 00:04:14
楼主PCR后的样品可能是蛋白质污染，目的片段的丰度低，而且从总RNA的电泳结果看28s片段有拖尾，所以还是建议楼主试试2步法RT-PCR看。

你是说PCR之后蛋白污染了?还是总RNA提取的时候蛋白污染了,我用的是trizol法,那个吹打过程要多久呢,我一般就吹个1分钟.我用培养瓶细胞的.
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5楼2013-04-07 10:14:09
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-07 10:13:19
那个RT-PCR的时候就已经加好了溴酚蓝了,然后放进机器里面再拿出来蓝色就会再底部沉淀,这样有没有影响呢,我上样品的时候要用枪吹匀才行...

溴酚蓝沉淀了？这有点奇怪吧。
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6楼2013-04-07 10:18:27
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emosgaogao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xjtu0025: 金币+1, ★有帮助 2013-04-07 21:52:23
引用回帖:
5楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-07 10:14:09
你是说PCR之后蛋白污染了?还是总RNA提取的时候蛋白污染了,我用的是trizol法,那个吹打过程要多久呢,我一般就吹个1分钟.我用培养瓶细胞的....

Trizol 吹打，目的只是让细胞完全裂解，所以时间不是衡量的标准，这是弹性的，能看到明显的细胞碎片就行，我们实验室是用plate，所以相对来说更方便些，楼主，很可能是提RNA的过程中出了问题，至于一步法PCR我还没做过，是不是加了特殊的酶，会不会对结果有影响。楼主说加了溴酚兰后有沉淀，这肯定是出了问题，提RNA最后一步干燥太久可能会出现这样的问题，RNA或DNA难溶于水，我曾经碰到这样的问题，楼主可以试试离心后用移液枪吸干后晾一会儿加水溶解。
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忍得住诱惑，耐得住寂寞
7楼2013-04-07 11:50:48
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-04-07 10:18:27
溴酚蓝沉淀了？这有点奇怪吧。...

对呀。。就是做完PCR之后拿出来，上面是浅色近乎于无色的，下面是深蓝色的。说明书说直接上洋，我就用吸头吹匀以后上，然后marker的溴酚蓝会往前跑，样品的不会。。。
用过南京凯基的一步氏RTPCR么
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8楼2013-04-07 21:46:33
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by emosgaogao at 2013-04-07 11:50:48
Trizol 吹打，目的只是让细胞完全裂解，所以时间不是衡量的标准，这是弹性的，能看到明显的细胞碎片就行，我们实验室是用plate，所以相对来说更方便些，楼主，很可能是提RNA的过程中出了问题，至于一步法PCR我还没 ...

溴酚蓝不是我加的，是PCRmix里面本身有的。南京凯基的一步氏试剂盒。
2×RT-PCR Mix                25μL
M-MLV/Taq Mix                1.5 μL
RNase抑制剂(40u/μL)         0.5 μL
2~5μg  RNA                n  μL
引物I (10μM)                1  μL
引物II (10μM)               1  μL
无核酸酶的双蒸水至总体积     50μL
我是按照顺序加的，那个mix就是蓝色的。
一步法就是把taq和MMLV混在一起了。
我没有干燥很久，我最后一步倾倒出乙醇后，就用移液器吸掉EP管口的最后一滴，然后直接加40ul处理好的水。

我现在的状态时连里面的内参都没有结果，上样孔很亮。

觉得很奇怪，我的RNA跑出来条带挺完整的。我今天又提了一次，6个样品，都是标准的3个带，28s两倍亮于18s，5s浅。
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9楼2013-04-07 21:52:13
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by emosgaogao at 2013-04-07 11:50:48
Trizol 吹打，目的只是让细胞完全裂解，所以时间不是衡量的标准，这是弹性的，能看到明显的细胞碎片就行，我们实验室是用plate，所以相对来说更方便些，楼主，很可能是提RNA的过程中出了问题，至于一步法PCR我还没 ...

没有跑变性电泳，所有有一点降解，并且胶是之前配好的。

新总RNA.jpg
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10楼2013-04-07 21:53:48
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