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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 一步RT-PRC后样品卡在凝胶孔了

提细胞总RNA，跑出三条带了，第一条比第二条亮一倍多。
然后RT-PCR用特异性引物做，阳性对照，阴性对照，实验组都没有东西，marker出来了。那三组凝胶孔发亮。
我加的模板是3微，由于没机会测浓度和OD260/280，第一次做的时候加了5微，也是一样的效果。
由于引物除了互补区外还加了酶切位点和保护碱基，就逆转录过后5个循环是不算酶切位点的退火温度，剩下做了25个循环是按照全长引物算的，大概提高了7度。
由于内参也没有做出来，我很是抑郁。
想知道，是不是就是因为我没有测纯度和浓度造成的。但是我跑总RNA的时候条带除了28s的两侧有一点拖尾，另外两条都很好，亮度也不错。

PS，如果我引物不是完全互补的，是不是会造成PCR的难度捏。那我是不是应该用两步RTPCR比较好？

拜托大神们了！

rtpcr.jpg



总RNA.jpg
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1楼 2013-04-06 18:16:16
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-07 21:46:33
对呀。。就是做完PCR之后拿出来，上面是浅色近乎于无色的，下面是深蓝色的。说明书说直接上洋，我就用吸头吹匀以后上，然后marker的溴酚蓝会往前跑，样品的不会。。。
用过南京凯基的一步氏RTPCR么...

感觉是试剂有问题.正常情况下溴酚蓝不应沉淀。
lz做个空白对照，就是把RNA换成水，做一次RT-PCR。如果溴酚蓝还是沉淀，保留该反应物，然后找卖你们试剂的人索赔。
但如果空白对照正常，就是你的RNA含有杂质了。
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15楼2013-04-08 22:22:10
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emosgaogao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-07 11:52:25
楼主PCR后的样品可能是蛋白质污染，目的片段的丰度低，而且从总RNA的电泳结果看28s片段有拖尾，所以还是建议楼主试试2步法RT-PCR看。
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忍得住诱惑，耐得住寂寞
2楼2013-04-07 00:04:14
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-07 11:52:35
检查一下RNA有没有降解了或RT PCR产物，多试几个手头现有的RT-PCR阳性参照。
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3楼2013-04-07 01:08:04
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2013-04-07 01:08:04
检查一下RNA有没有降解了或RT PCR产物，多试几个手头现有的RT-PCR阳性参照。

那个RT-PCR的时候就已经加好了溴酚蓝了,然后放进机器里面再拿出来蓝色就会再底部沉淀,这样有没有影响呢,我上样品的时候要用枪吹匀才行
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4楼2013-04-07 10:13:19
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