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xjtu0025

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[求助] 一步RT-PRC后样品卡在凝胶孔了

提细胞总RNA，跑出三条带了，第一条比第二条亮一倍多。
然后RT-PCR用特异性引物做，阳性对照，阴性对照，实验组都没有东西，marker出来了。那三组凝胶孔发亮。
我加的模板是3微，由于没机会测浓度和OD260/280，第一次做的时候加了5微，也是一样的效果。
由于引物除了互补区外还加了酶切位点和保护碱基，就逆转录过后5个循环是不算酶切位点的退火温度，剩下做了25个循环是按照全长引物算的，大概提高了7度。
由于内参也没有做出来，我很是抑郁。
想知道，是不是就是因为我没有测纯度和浓度造成的。但是我跑总RNA的时候条带除了28s的两侧有一点拖尾，另外两条都很好，亮度也不错。

PS，如果我引物不是完全互补的，是不是会造成PCR的难度捏。那我是不是应该用两步RTPCR比较好？

拜托大神们了！

rtpcr.jpg

总RNA.jpg

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1楼 2013-04-06 18:16:16

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XOooZzz

银虫 (小有名气)

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引用回帖:

8楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-07 21:46:33
对呀。。就是做完PCR之后拿出来，上面是浅色近乎于无色的，下面是深蓝色的。说明书说直接上洋，我就用吸头吹匀以后上，然后marker的溴酚蓝会往前跑，样品的不会。。。
用过南京凯基的一步氏RTPCR么...

感觉是试剂有问题.正常情况下溴酚蓝不应沉淀。
lz做个空白对照，就是把RNA换成水，做一次RT-PCR。如果溴酚蓝还是沉淀，保留该反应物，然后找卖你们试剂的人索赔。
但如果空白对照正常，就是你的RNA含有杂质了。