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一步RT-PRC后样品卡在凝胶孔了
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提细胞总RNA，跑出三条带了，第一条比第二条亮一倍多。 然后RT-PCR用特异性引物做，阳性对照，阴性对照，实验组都没有东西，marker出来了。那三组凝胶孔发亮。 我加的模板是3微，由于没机会测浓度和OD260/280，第一次做的时候加了5微，也是一样的效果。 由于引物除了互补区外还加了酶切位点和保护碱基，就逆转录过后5个循环是不算酶切位点的退火温度，剩下做了25个循环是按照全长引物算的，大概提高了7度。 由于内参也没有做出来，我很是抑郁。 想知道，是不是就是因为我没有测纯度和浓度造成的。但是我跑总RNA的时候条带除了28s的两侧有一点拖尾，另外两条都很好，亮度也不错。 PS，如果我引物不是完全互补的，是不是会造成PCR的难度捏。那我是不是应该用两步RTPCR比较好？ 拜托大神们了！  rtpcr.jpg  总RNA.jpg |
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溴酚蓝不是我加的，是PCRmix里面本身有的。南京凯基的一步氏试剂盒。 2×RT-PCR Mix 25μL M-MLV/Taq Mix 1.5 μL RNase抑制剂(40u/μL) 0.5 μL 2~5μg RNA n μL 引物I (10μM) 1 μL 引物II (10μM) 1 μL 无核酸酶的双蒸水至总体积 50μL 我是按照顺序加的，那个mix就是蓝色的。 一步法就是把taq和MMLV混在一起了。 我没有干燥很久，我最后一步倾倒出乙醇后，就用移液器吸掉EP管口的最后一滴，然后直接加40ul处理好的水。 我现在的状态时连里面的内参都没有结果，上样孔很亮。 觉得很奇怪，我的RNA跑出来条带挺完整的。我今天又提了一次，6个样品，都是标准的3个带，28s两倍亮于18s，5s浅。 |
9楼2013-04-07 21:52:13
emosgaogao
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2楼2013-04-07 00:04:14
mitocam
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3楼2013-04-07 01:08:04
4楼2013-04-07 10:13:19
40