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xjtu0025

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[求助] 一步RT-PRC后样品卡在凝胶孔了

提细胞总RNA，跑出三条带了，第一条比第二条亮一倍多。
然后RT-PCR用特异性引物做，阳性对照，阴性对照，实验组都没有东西，marker出来了。那三组凝胶孔发亮。
我加的模板是3微，由于没机会测浓度和OD260/280，第一次做的时候加了5微，也是一样的效果。
由于引物除了互补区外还加了酶切位点和保护碱基，就逆转录过后5个循环是不算酶切位点的退火温度，剩下做了25个循环是按照全长引物算的，大概提高了7度。
由于内参也没有做出来，我很是抑郁。
想知道，是不是就是因为我没有测纯度和浓度造成的。但是我跑总RNA的时候条带除了28s的两侧有一点拖尾，另外两条都很好，亮度也不错。

PS，如果我引物不是完全互补的，是不是会造成PCR的难度捏。那我是不是应该用两步RTPCR比较好？

拜托大神们了！

rtpcr.jpg

总RNA.jpg

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1楼 2013-04-06 18:16:16

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xjtu0025

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引用回帖:

7楼: Originally posted by emosgaogao at 2013-04-07 11:50:48
Trizol 吹打，目的只是让细胞完全裂解，所以时间不是衡量的标准，这是弹性的，能看到明显的细胞碎片就行，我们实验室是用plate，所以相对来说更方便些，楼主，很可能是提RNA的过程中出了问题，至于一步法PCR我还没 ...

溴酚蓝不是我加的，是PCRmix里面本身有的。南京凯基的一步氏试剂盒。
2×RT-PCR Mix             25μL
M-MLV/Taq Mix             1.5 μL
RNase抑制剂(40u/μL)       0.5 μL
2~5μg  RNA             n  μL
引物I (10μM)             1  μL
引物II (10μM)             1  μL
无核酸酶的双蒸水至总体积    50μL
我是按照顺序加的，那个mix就是蓝色的。
一步法就是把taq和MMLV混在一起了。
我没有干燥很久，我最后一步倾倒出乙醇后，就用移液器吸掉EP管口的最后一滴，然后直接加40ul处理好的水。

我现在的状态时连里面的内参都没有结果，上样孔很亮。

觉得很奇怪，我的RNA跑出来条带挺完整的。我今天又提了一次，6个样品，都是标准的3个带，28s两倍亮于18s，5s浅。