应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » P32 5'标记一定要dephosphorylation吗，不用会怎样..谢谢!!
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 1307  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)

[求助] P32 5'标记一定要dephosphorylation吗，不用会怎样..谢谢!!

我用P32 5'端标记miRNA protocol里说要dephosphorylation（加phosphatase），然后再加gamma P32 标记。
但是我标记后在imager里看不到样品的band怎么办？
相应的RNAmarker也是用5‘端标记，没有经过dephosphorylation，可以用磷的imager看到黑带。
求助。非常感激。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-24 05:24:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 01:38:54
纯化小分子会有较大损失，这很正常，你用的什么方法纯化的？你能否加大初始样品的量？...

是，损失很大，
具体过程是这样的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)纯化，纯化后浓度在200ng/微升，感觉应该够用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿试剂纯化，再后用纯化后的miRNA与gamma P32, kinase等label, 然后用spin coulumn纯化。
这一步纯化后因为楼里没有scintilation counter，所以我直接跑胶（polyacrylamide 15%）。

除去5‘end label，我还做了未经dephosphorylation步骤的gamma p32label以及在transcription过程中用alpha p32 标记。
今天在screen上expose了近7个小时，仍然看不到band... 快急死了。。。
谢谢。。
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-26 07:34:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-24 19:40:00
marker这类体外合成的分子通常是不带5'P的，所以可以直接标记。一般生物合成的分子本身带有5'P，不去磷酸化的话就标记不上P32的。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-03-24 11:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-24 11:47:55
marker这类体外合成的分子通常是不带5'P的，所以可以直接标记。一般生物合成的分子本身带有5'P，不去磷酸化的话就标记不上P32的。

谢谢！
但是我去磷酸化之后，纯化后，miRNA浓度非常低5ng/微升左右，label的方子是gamma p32, t4kinase, t4kinase buffer和水，
expose 4.5hr, 之后观察不到miRNA本身的band.
miRNA长度在72个bp左右
再次感谢。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-25 22:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-03-25 22:46:09
谢谢！
但是我去磷酸化之后，纯化后，miRNA浓度非常低5ng/微升左右，label的方子是gamma p32, t4kinase, t4kinase buffer和水，
expose 4.5hr, 之后观察不到miRNA本身的band.
miRNA长度在72个bp左右
再次感谢。...

纯化小分子会有较大损失，这很正常，你用的什么方法纯化的？你能否加大初始样品的量？
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-26 01:38:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 329求调剂 +7 星野? 2026-03-26 7/350 2026-03-29 06:43 by 544594351
[考研] 070300化学354求调剂 +4 101次希望 2026-03-28 4/200 2026-03-29 06:19 by 松花缸1201
[考研] 085701求调剂初试286分 +4 secret0328 2026-03-28 4/200 2026-03-28 21:09 by 15366876211
[考研] 本科新能源科学与工程，一志愿华理能动285求调剂 +3 AZMK 2026-03-27 5/250 2026-03-28 16:19 by xxxsssccc
[考研] 275求调剂 +10 Micky11223 2026-03-25 14/700 2026-03-28 15:48 by Micky11223
[考研] 复试调剂 +3 raojunqi0129 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:27 by 落睿可思
[考研] 085600，材料与化工321分求调剂 +9 大馋小子 2026-03-28 9/450 2026-03-28 14:56 by 神马都不懂
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-27 6/300 2026-03-28 14:10 by 唐沐儿
[考研] 张芳铭-中国农业大学-环境工程专硕-298 +4 手机用户 2026-03-26 4/200 2026-03-28 07:17 by mmm just
[考研] 086502化学工程342求调剂 +6 阿姨复古不过 2026-03-27 6/300 2026-03-28 07:06 by wangy0907
[考研] 086000调剂 +3 7901117076 2026-03-26 3/150 2026-03-27 21:34 by Jianing_Mi
[考研] 考研调剂 +4 Sanmu-124 2026-03-26 4/200 2026-03-27 17:49 by kiokin
[考研] 333求调剂 +3 question挽风 2026-03-23 3/150 2026-03-27 11:29 by 不吃魚的貓
[考研] 325求调剂 +5 李嘉图·S·路 2026-03-23 5/250 2026-03-27 00:42 by wxiongid
[考研] 336材料求调剂 +7 陈滢莹 2026-03-26 9/450 2026-03-27 00:20 by wxiongid
[考研] 材料与化工328分调剂 +6 。，。，。，。i 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 考研一志愿苏州大学初始315（英一）求调剂 +3 sbdksD 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:16 by xcjcqu
[考研] 0854电子信息求调剂 +7 α____ 2026-03-22 9/450 2026-03-25 13:37 by α____
[考研] 344求调剂 +3 desto 2026-03-24 3/150 2026-03-24 10:09 by 搏击518
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭