应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » P32 5'标记一定要dephosphorylation吗，不用会怎样..谢谢!!
81/1返回列表
查看: 1470  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)

[求助] P32 5'标记一定要dephosphorylation吗，不用会怎样..谢谢!!

我用P32 5'端标记miRNA protocol里说要dephosphorylation（加phosphatase），然后再加gamma P32 标记。
但是我标记后在imager里看不到样品的band怎么办？
相应的RNAmarker也是用5‘端标记，没有经过dephosphorylation，可以用磷的imager看到黑带。
求助。非常感激。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-24 05:24:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-24 19:40:00
marker这类体外合成的分子通常是不带5'P的，所以可以直接标记。一般生物合成的分子本身带有5'P，不去磷酸化的话就标记不上P32的。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-03-24 11:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-24 11:47:55
marker这类体外合成的分子通常是不带5'P的，所以可以直接标记。一般生物合成的分子本身带有5'P，不去磷酸化的话就标记不上P32的。

谢谢！
但是我去磷酸化之后，纯化后，miRNA浓度非常低5ng/微升左右，label的方子是gamma p32, t4kinase, t4kinase buffer和水，
expose 4.5hr, 之后观察不到miRNA本身的band.
miRNA长度在72个bp左右
再次感谢。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-25 22:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-03-25 22:46:09
谢谢！
但是我去磷酸化之后，纯化后，miRNA浓度非常低5ng/微升左右，label的方子是gamma p32, t4kinase, t4kinase buffer和水，
expose 4.5hr, 之后观察不到miRNA本身的band.
miRNA长度在72个bp左右
再次感谢。...

纯化小分子会有较大损失，这很正常，你用的什么方法纯化的？你能否加大初始样品的量？
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-26 01:38:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 01:38:54
纯化小分子会有较大损失，这很正常，你用的什么方法纯化的？你能否加大初始样品的量？...

是，损失很大，
具体过程是这样的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)纯化，纯化后浓度在200ng/微升，感觉应该够用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿试剂纯化，再后用纯化后的miRNA与gamma P32, kinase等label, 然后用spin coulumn纯化。
这一步纯化后因为楼里没有scintilation counter，所以我直接跑胶（polyacrylamide 15%）。

除去5‘end label，我还做了未经dephosphorylation步骤的gamma p32label以及在transcription过程中用alpha p32 标记。
今天在screen上expose了近7个小时，仍然看不到band... 快急死了。。。
谢谢。。
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-26 07:34:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-03-26 07:34:38
是，损失很大，
具体过程是这样的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)纯化，纯化后浓度在200ng/微升，感觉应该够用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿试剂纯化，再后 ...

你确定同位素好用吗？P32的半衰期大致是两周，要用比较新鲜的同位素标记才好，最好是合成出来的一周内做实验。
赞一下 回复此楼
6楼2013-03-26 12:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 12:18:43
你确定同位素好用吗？P32的半衰期大致是两周，要用比较新鲜的同位素标记才好，最好是合成出来的一周内做实验。...

还好，是在一周左右做的，
后来老师发现RNA的模板浓度太低（16ng/微升），不知道这个会不会影响后面的反应。
我做了十管50微升的反应，30个cycle,温度分别是98,98,58,72，4 摄氏度。然后我把十管收集起来一起纯化，（cycle pure kit）,纯化后浓度只有23ng/微升。

但是听老师说要想做后面的转录，模板浓度要至少在微克数量级，
我该怎么提高模板浓度，
miRNA的分子量在72bp，它的模板应该也不大，谢谢^ ^
赞一下 回复此楼
7楼2013-04-03 23:45:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-04-03 23:45:07
还好，是在一周左右做的，
后来老师发现RNA的模板浓度太低（16ng/微升），不知道这个会不会影响后面的反应。
我做了十管50微升的反应，30个cycle,温度分别是98,98,58,72，4 摄氏度。然后我把十管收集起来一起纯化 ...

我觉得你可以试试增加扩增的循环数至35-40，增加反应体系体积之100μl。实在不行再多做几管。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2013-04-04 02:34:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jinqimaggie 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭