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jinqimaggie铁虫 (小有名气)
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[求助]
P32 5'标记一定要dephosphorylation吗，不用会怎样..谢谢!!
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我用P32 5'端标记miRNA protocol里说要dephosphorylation（加phosphatase），然后再加gamma P32 标记。 但是我标记后在imager里看不到样品的band怎么办？ 相应的RNAmarker也是用5‘端标记，没有经过dephosphorylation，可以用磷的imager看到黑带。 求助。非常感激。 |
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4楼2013-03-26 01:38:54
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是，损失很大， 具体过程是这样的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)纯化，纯化后浓度在200ng/微升，感觉应该够用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿试剂纯化，再后用纯化后的miRNA与gamma P32, kinase等label, 然后用spin coulumn纯化。 这一步纯化后因为楼里没有scintilation counter，所以我直接跑胶（polyacrylamide 15%）。 除去5‘end label，我还做了未经dephosphorylation步骤的gamma p32label以及在transcription过程中用alpha p32 标记。 今天在screen上expose了近7个小时，仍然看不到band... 快急死了。。。 谢谢。。 |
5楼2013-03-26 07:34:38