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jinqimaggie

铁虫 (小有名气)

[求助] P32 5'标记一定要dephosphorylation吗，不用会怎样..谢谢!!

我用P32 5'端标记miRNA protocol里说要dephosphorylation（加phosphatase），然后再加gamma P32 标记。
但是我标记后在imager里看不到样品的band怎么办？
相应的RNAmarker也是用5‘端标记，没有经过dephosphorylation，可以用磷的imager看到黑带。
求助。非常感激。
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1楼 2013-03-24 05:24:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-24 19:40:00
marker这类体外合成的分子通常是不带5'P的，所以可以直接标记。一般生物合成的分子本身带有5'P，不去磷酸化的话就标记不上P32的。
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2楼2013-03-24 11:47:55
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jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-24 11:47:55
marker这类体外合成的分子通常是不带5'P的，所以可以直接标记。一般生物合成的分子本身带有5'P，不去磷酸化的话就标记不上P32的。

谢谢！
但是我去磷酸化之后，纯化后，miRNA浓度非常低5ng/微升左右，label的方子是gamma p32, t4kinase, t4kinase buffer和水，
expose 4.5hr, 之后观察不到miRNA本身的band.
miRNA长度在72个bp左右
再次感谢。
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3楼2013-03-25 22:46:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-03-25 22:46:09
谢谢！
但是我去磷酸化之后，纯化后，miRNA浓度非常低5ng/微升左右，label的方子是gamma p32, t4kinase, t4kinase buffer和水，
expose 4.5hr, 之后观察不到miRNA本身的band.
miRNA长度在72个bp左右
再次感谢。...

纯化小分子会有较大损失，这很正常，你用的什么方法纯化的？你能否加大初始样品的量？
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4楼2013-03-26 01:38:54
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jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 01:38:54
纯化小分子会有较大损失，这很正常，你用的什么方法纯化的？你能否加大初始样品的量？...

是，损失很大，
具体过程是这样的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)纯化，纯化后浓度在200ng/微升，感觉应该够用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿试剂纯化，再后用纯化后的miRNA与gamma P32, kinase等label, 然后用spin coulumn纯化。
这一步纯化后因为楼里没有scintilation counter，所以我直接跑胶（polyacrylamide 15%）。

除去5‘end label，我还做了未经dephosphorylation步骤的gamma p32label以及在transcription过程中用alpha p32 标记。
今天在screen上expose了近7个小时，仍然看不到band... 快急死了。。。
谢谢。。
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5楼2013-03-26 07:34:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-03-26 07:34:38
是，损失很大，
具体过程是这样的，我想做5’end label ，首先transcript，然后用isolation kit(酚仿)纯化，纯化后浓度在200ng/微升，感觉应该够用，然后做dephosphorylation , 用CIP做之后，用酚仿试剂纯化，再后 ...

你确定同位素好用吗？P32的半衰期大致是两周，要用比较新鲜的同位素标记才好，最好是合成出来的一周内做实验。
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6楼2013-03-26 12:18:43
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jinqimaggie

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-26 12:18:43
你确定同位素好用吗？P32的半衰期大致是两周，要用比较新鲜的同位素标记才好，最好是合成出来的一周内做实验。...

还好，是在一周左右做的，
后来老师发现RNA的模板浓度太低（16ng/微升），不知道这个会不会影响后面的反应。
我做了十管50微升的反应，30个cycle,温度分别是98,98,58,72，4 摄氏度。然后我把十管收集起来一起纯化，（cycle pure kit）,纯化后浓度只有23ng/微升。

但是听老师说要想做后面的转录，模板浓度要至少在微克数量级，
我该怎么提高模板浓度，
miRNA的分子量在72bp，它的模板应该也不大，谢谢^ ^
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7楼2013-04-03 23:45:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by jinqimaggie at 2013-04-03 23:45:07
还好，是在一周左右做的，
后来老师发现RNA的模板浓度太低（16ng/微升），不知道这个会不会影响后面的反应。
我做了十管50微升的反应，30个cycle,温度分别是98,98,58,72，4 摄氏度。然后我把十管收集起来一起纯化 ...

我觉得你可以试试增加扩增的循环数至35-40，增加反应体系体积之100μl。实在不行再多做几管。
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8楼2013-04-04 02:34:48
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