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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 摇菌 不浑浊
汕头大学海洋科学接受调剂
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-20 16:25:10
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-03-21 11:27:51
你若是抗性什么都没问题的话，这应该属于你的质粒在大肠杆菌中不稳定的现象。你的插入片段应该不大吧   你先把你之前的菌液PCR鉴定下  看还有没有质粒。另外，你摇了多久没有摇浑浊？有没超过18小时？你可以一直摇着，看什么时候能摇起来，摇起来之后菌液PCR鉴定下，看是不是有你的质粒。若是有，那就是所谓的有毒性，在大肠里不稳定了。若是这样，你可以试着在较低的温度如30度下摇摇，不过时间至少也要18小时左右才行。也可以换宿主菌试下。我构的病毒载体就 是这样不稳定的，很烦人，拷贝数好低，质粒浓度上不去。想死的心都有。
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11楼2013-03-20 14:00:20
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雅典娜1008

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by fayzhao at 2013-03-20 12:59:04
平板和液体培养基的抗生素是一样的，包括浓度也是一样的……我之前也没遇到这种问题，就这次不知道怎么回事啊...

实在不行把培养基什么的全部重新配，送测序时挑的单克隆摇菌都能摇起来，这个肯定也能
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平静、淡然、感恩
12楼2013-03-20 14:31:26
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by tuodecai at 2013-03-20 14:00:20
你若是抗性什么都没问题的话，这应该属于你的质粒在大肠杆菌中不稳定的现象。你的插入片段应该不大吧   你先把你之前的菌液PCR鉴定下  看还有没有质粒。另外，你摇了多久没有摇浑浊？有没超过18小时？你可以一直摇着 ...

可是我第一次挑菌之后摇6小时就浑浊了呀，还测序测出来了呢，应该不会有毒性吧。后来摇菌都是摇12~16小时，都不浑浊。我打算再做一遍……

并且菌液放在4℃冰箱里应该不会死吧，但是后来看摇菌和涂平板的情况，感觉菌活力好低好低，应该有一部分菌都死了……想不通啊想不通，天天都睡不好，愁死了
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13楼2013-03-20 16:33:11
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 雅典娜1008 at 2013-03-20 14:31:26
实在不行把培养基什么的全部重新配，送测序时挑的单克隆摇菌都能摇起来，这个肯定也能...

是啊，我也是这么认为的，所以我借了别人的培养基也摇不起来，然后我又自己重新配了培养基，还是摇不起来。我实在想不明白了……
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14楼2013-03-20 16:34:35
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雅典娜1008

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by fayzhao at 2013-03-20 12:59:04
平板和液体培养基的抗生素是一样的，包括浓度也是一样的……我之前也没遇到这种问题，就这次不知道怎么回事啊...

这也太诡异了，我还是觉得哪出问题了，楼主多试两遍，等找到问题所在告诉我一声啊，我很好奇，呵呵~
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平静、淡然、感恩
15楼2013-03-20 20:27:15
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
fayzhao: 金币+4 2013-03-21 09:17:48
引用回帖:
13楼: Originally posted by fayzhao at 2013-03-20 16:33:11
可是我第一次挑菌之后摇6小时就浑浊了呀，还测序测出来了呢，应该不会有毒性吧。后来摇菌都是摇12~16小时，都不浑浊。我打算再做一遍……

并且菌液放在4℃冰箱里应该不会死吧，但是后来看摇菌和涂平板的情况，感 ...

其实我也遇到过跟你一样觉得很巧的事儿，我就有一次构建出的差不多插入10kb的病毒序列载体，刚开始鉴定出来的菌提质粒特别高可达到1ug/ul以上，可后来菌放了一段时间，连我-80度保存的甘油管拿出来再摇菌再也没那效果了，基本上都是50ng/ul不到。其实对于正常的菌在4度或-80度存放过的，菌的活力都会下降，一般都会先来个活化的过程。但对不太稳定的菌来说，那就更是如此了。一般菌液在4度放个一个月左右都还是有活性的，就像你说的时间不是很长的话，活力下降得很多，可见你的质粒确实不太稳定。哦，你好像是说，你构的是RNAi干扰载体吧？若是这样，你的插入序列有反向重复序列吧，若是这样，不稳定的可能性就更大了。你可以试着重新构好，转化看看效果。就知道是不你的载体导致的菌的不稳定。若排除常见的小问题，我觉得这种情况比较大！
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16楼2013-03-20 23:30:42
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fenghaizai

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-21 09:20:31
Phage
如果不加抗生素也摇不浑浊的话，基本上就可以确定是Phage污染的问题了。
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17楼2013-03-21 07:39:28
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雪之魂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2 2013-03-21 09:20:41
第一，是否你的蛋白容易降解？；
第二，可能有噬菌体污染的情况，每次灭菌时间是否充足？
第三，可以用空载的质粒试试，验证下你哪里出了问题~
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膜蛋白，NMR，样品制备。。难啊~
18楼2013-03-21 08:24:18
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by tuodecai at 2013-03-20 23:30:42
其实我也遇到过跟你一样觉得很巧的事儿，我就有一次构建出的差不多插入10kb的病毒序列载体，刚开始鉴定出来的菌提质粒特别高可达到1ug/ul以上，可后来菌放了一段时间，连我-80度保存的甘油管拿出来再摇菌再也没那效 ...

我之前做的一个基因就非常顺利，就是这学期做的成了这样。
测序都测出来了，菌液就在4℃冰箱放了2天……可能有不稳定的因素吧，我再重新做一遍好了。
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19楼2013-03-21 09:17:43
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zonka

新虫 (初入文坛)
请问你怎么解决的呀 我最近也出现了这种现象哎，每天看到澄清的LB很懵逼啊
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20楼2017-07-04 16:08:35
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