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fayzhao

金虫 (小有名气)

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[求助] 摇菌不浑浊已有1人参与

各位好，
目前我正在做的是构建表达载体，我做的是线虫RNAi。

具体步骤是这样的：
双酶切得到正确的目的基因片段，连接到L4440载体，转化到大肠杆菌HT115中，挑单克隆测序，将阳性克隆菌液保存。

遇到的问题是这样的：
首先说明一下LB培养基没有问题（因为同时摇的还有其他菌，且浑浊）。
测序正确的菌液无法摇浑浊。接着我将菌液涂平板以复壮，但是挑到的单菌落还是无法摇浑浊。接下来我将最初转化时涂的平板拿出来（已在4℃保存一周），挑取上面的单菌落摇菌，仍然不能摇浑。

我实在是找不到原因了，无奈啊，希望知道方法的同道帮帮忙啊，O(∩_∩)O谢谢啦

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1楼 2013-03-19 14:25:30

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fayzhao

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引用回帖:

11楼: Originally posted by tuodecai at 2013-03-20 14:00:20
你若是抗性什么都没问题的话，这应该属于你的质粒在大肠杆菌中不稳定的现象。你的插入片段应该不大吧你先把你之前的菌液PCR鉴定下看还有没有质粒。另外，你摇了多久没有摇浑浊？有没超过18小时？你可以一直摇着 ...

可是我第一次挑菌之后摇6小时就浑浊了呀，还测序测出来了呢，应该不会有毒性吧。后来摇菌都是摇12~16小时，都不浑浊。我打算再做一遍……

并且菌液放在4℃冰箱里应该不会死吧，但是后来看摇菌和涂平板的情况，感觉菌活力好低好低，应该有一部分菌都死了……想不通啊想不通，天天都睡不好，愁死了