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fayzhao金虫 (小有名气)
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摇菌 不浑浊 已有1人参与
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各位好， 目前我正在做的是构建表达载体，我做的是线虫RNAi。 具体步骤是这样的： 双酶切得到正确的目的基因片段，连接到L4440载体，转化到大肠杆菌HT115中，挑单克隆测序，将阳性克隆菌液保存。 遇到的问题是这样的： 首先说明一下LB培养基没有问题（因为同时摇的还有其他菌，且浑浊）。 测序正确的菌液无法摇浑浊。接着我将菌液涂平板以复壮，但是挑到的单菌落还是无法摇浑浊。接下来我将最初转化时涂的平板拿出来（已在4℃保存一周），挑取上面的单菌落摇菌，仍然不能摇浑。 我实在是找不到原因了，无奈啊，希望知道方法的同道帮帮忙啊，O(∩_∩)O谢谢啦 |
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 分子生化实验经验积累 |
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你若是抗性什么都没问题的话，这应该属于你的质粒在大肠杆菌中不稳定的现象。你的插入片段应该不大吧 你先把你之前的菌液PCR鉴定下 看还有没有质粒。另外，你摇了多久没有摇浑浊？有没超过18小时？你可以一直摇着，看什么时候能摇起来，摇起来之后菌液PCR鉴定下，看是不是有你的质粒。若是有，那就是所谓的有毒性，在大肠里不稳定了。若是这样，你可以试着在较低的温度如30度下摇摇，不过时间至少也要18小时左右才行。也可以换宿主菌试下。我构的病毒载体就 是这样不稳定的，很烦人，拷贝数好低，质粒浓度上不去。想死的心都有。 |
11楼2013-03-20 14:00:20
lijuan211715
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