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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 摇菌 不浑浊
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fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 摇菌 不浑浊 已有1人参与

各位好，
目前我正在做的是构建表达载体，我做的是线虫RNAi。

具体步骤是这样的：
双酶切得到正确的目的基因片段，连接到L4440载体，转化到大肠杆菌HT115中，挑单克隆测序，将阳性克隆菌液保存。

遇到的问题是这样的：
首先说明一下LB培养基没有问题（因为同时摇的还有其他菌，且浑浊）。
测序正确的菌液无法摇浑浊。接着我将菌液涂平板以复壮，但是挑到的单菌落还是无法摇浑浊。接下来我将最初转化时涂的平板拿出来（已在4℃保存一周），挑取上面的单菌落摇菌，仍然不能摇浑。

我实在是找不到原因了，无奈啊，希望知道方法的同道帮帮忙啊，O(∩_∩)O谢谢啦
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1楼 2013-03-19 14:25:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-19 18:12:24
考虑过抗性的问题没？会不会是抗生素搞错了。挑单菌落时尽量养肥一点，只要没有卫星菌落就行，要确保挑到了菌！
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2楼2013-03-19 16:45:12
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守好我的道

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-20 12:57:39
转化的菌可能有问题了，个人建议：用测序正确的质粒重新转化平板吧。
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7楼2013-03-19 22:03:58
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-20 16:25:10
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-03-21 11:27:51
你若是抗性什么都没问题的话，这应该属于你的质粒在大肠杆菌中不稳定的现象。你的插入片段应该不大吧   你先把你之前的菌液PCR鉴定下  看还有没有质粒。另外，你摇了多久没有摇浑浊？有没超过18小时？你可以一直摇着，看什么时候能摇起来，摇起来之后菌液PCR鉴定下，看是不是有你的质粒。若是有，那就是所谓的有毒性，在大肠里不稳定了。若是这样，你可以试着在较低的温度如30度下摇摇，不过时间至少也要18小时左右才行。也可以换宿主菌试下。我构的病毒载体就 是这样不稳定的，很烦人，拷贝数好低，质粒浓度上不去。想死的心都有。
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11楼2013-03-20 14:00:20
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普通回帖

lijuan211715

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-19 18:13:08
是不是你要表达的对宿主菌有毒性啊
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3楼2013-03-19 17:23:17
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-19 16:45:12
考虑过抗性的问题没？会不会是抗生素搞错了。挑单菌落时尽量养肥一点，只要没有卫星菌落就行，要确保挑到了菌！

抗生素没有错，一直都是那样用的，换了两次培养基了，都是摇不浑浊……
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4楼2013-03-19 18:13:03
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lijuan211715 at 2013-03-19 17:23:17
是不是你要表达的对宿主菌有毒性啊

不知道呢，这个怎么判断呀？
关键是之前挑菌后摇浑浊了呀，后面才不能浑浊的……
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5楼2013-03-19 18:14:24
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-20 12:57:22
摇床的温度测一下
或者你用之前的菌液再摇菌
或者把冻存的菌液复苏
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
6楼2013-03-19 20:13:57
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雅典娜1008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2 2013-03-20 12:57:58
平板上用的抗生素跟液体培养基的完全一样吗？如果液体培养基没有问题，培养条件也没问题的话那应该不会出现这种情况，我做了N多个了，从来没遇到过！我觉得很有可能是你觉得不可能出错的地方出错了，楼主还是再仔细回想一下吧，不行把培养基、抗生素之类的全重配

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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平静、淡然、感恩
8楼2013-03-19 23:52:17
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当下的距离

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-20 12:58:05
是不是转化出的问题？没有转进去？
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youcangetwhatyouwantifyouwantitenough.
9楼2013-03-20 00:49:40
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 雅典娜1008 at 2013-03-19 23:52:17
平板上用的抗生素跟液体培养基的完全一样吗？如果液体培养基没有问题，培养条件也没问题的话那应该不会出现这种情况，我做了N多个了，从来没遇到过！我觉得很有可能是你觉得不可能出错的地方出错了，楼主还是再仔细 ...

平板和液体培养基的抗生素是一样的，包括浓度也是一样的……我之前也没遇到这种问题，就这次不知道怎么回事啊
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10楼2013-03-20 12:59:04
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