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fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 摇菌 不浑浊 已有1人参与

各位好,
目前我正在做的是构建表达载体,我做的是线虫RNAi。

具体步骤是这样的:
双酶切得到正确的目的基因片段,连接到L4440载体,转化到大肠杆菌HT115中,挑单克隆测序,将阳性克隆菌液保存。

遇到的问题是这样的:
首先说明一下LB培养基没有问题(因为同时摇的还有其他菌,且浑浊)。
测序正确的菌液无法摇浑浊。接着我将菌液涂平板以复壮,但是挑到的单菌落还是无法摇浑浊。接下来我将最初转化时涂的平板拿出来(已在4℃保存一周),挑取上面的单菌落摇菌,仍然不能摇浑。

我实在是找不到原因了,无奈啊,希望知道方法的同道帮帮忙啊,O(∩_∩)O谢谢啦
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雪之魂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+2 2013-03-21 09:20:41
第一,是否你的蛋白容易降解?;
第二,可能有噬菌体污染的情况,每次灭菌时间是否充足?
第三,可以用空载的质粒试试,验证下你哪里出了问题~
膜蛋白,NMR,样品制备。。难啊~
18楼2013-03-21 08:24:18
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-19 18:12:24
考虑过抗性的问题没?会不会是抗生素搞错了。挑单菌落时尽量养肥一点,只要没有卫星菌落就行,要确保挑到了菌!
2楼2013-03-19 16:45:12
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lijuan211715

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-03-19 18:13:08
是不是你要表达的对宿主菌有毒性啊
3楼2013-03-19 17:23:17
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fayzhao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-19 16:45:12
考虑过抗性的问题没?会不会是抗生素搞错了。挑单菌落时尽量养肥一点,只要没有卫星菌落就行,要确保挑到了菌!

抗生素没有错,一直都是那样用的,换了两次培养基了,都是摇不浑浊……
4楼2013-03-19 18:13:03
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