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fayzhao

金虫 (小有名气)

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[求助] 摇菌不浑浊已有1人参与

各位好，
目前我正在做的是构建表达载体，我做的是线虫RNAi。

具体步骤是这样的：
双酶切得到正确的目的基因片段，连接到L4440载体，转化到大肠杆菌HT115中，挑单克隆测序，将阳性克隆菌液保存。

遇到的问题是这样的：
首先说明一下LB培养基没有问题（因为同时摇的还有其他菌，且浑浊）。
测序正确的菌液无法摇浑浊。接着我将菌液涂平板以复壮，但是挑到的单菌落还是无法摇浑浊。接下来我将最初转化时涂的平板拿出来（已在4℃保存一周），挑取上面的单菌落摇菌，仍然不能摇浑。

我实在是找不到原因了，无奈啊，希望知道方法的同道帮帮忙啊，O(∩_∩)O谢谢啦

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1楼 2013-03-19 14:25:30

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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
fayzhao: 金币+4 2013-03-21 09:17:48

引用回帖:

13楼: Originally posted by fayzhao at 2013-03-20 16:33:11
可是我第一次挑菌之后摇6小时就浑浊了呀，还测序测出来了呢，应该不会有毒性吧。后来摇菌都是摇12~16小时，都不浑浊。我打算再做一遍……

并且菌液放在4℃冰箱里应该不会死吧，但是后来看摇菌和涂平板的情况，感 ...

其实我也遇到过跟你一样觉得很巧的事儿，我就有一次构建出的差不多插入10kb的病毒序列载体，刚开始鉴定出来的菌提质粒特别高可达到1ug/ul以上，可后来菌放了一段时间，连我-80度保存的甘油管拿出来再摇菌再也没那效果了，基本上都是50ng/ul不到。其实对于正常的菌在4度或-80度存放过的，菌的活力都会下降，一般都会先来个活化的过程。但对不太稳定的菌来说，那就更是如此了。一般菌液在4度放个一个月左右都还是有活性的，就像你说的时间不是很长的话，活力下降得很多，可见你的质粒确实不太稳定。哦，你好像是说，你构的是RNAi干扰载体吧？若是这样，你的插入序列有反向重复序列吧，若是这样，不稳定的可能性就更大了。你可以试着重新构好，转化看看效果。就知道是不你的载体导致的菌的不稳定。若排除常见的小问题，我觉得这种情况比较大！