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fayzhao

金虫 (小有名气)

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[求助] 摇菌不浑浊已有1人参与

各位好，
目前我正在做的是构建表达载体，我做的是线虫RNAi。

具体步骤是这样的：
双酶切得到正确的目的基因片段，连接到L4440载体，转化到大肠杆菌HT115中，挑单克隆测序，将阳性克隆菌液保存。

遇到的问题是这样的：
首先说明一下LB培养基没有问题（因为同时摇的还有其他菌，且浑浊）。
测序正确的菌液无法摇浑浊。接着我将菌液涂平板以复壮，但是挑到的单菌落还是无法摇浑浊。接下来我将最初转化时涂的平板拿出来（已在4℃保存一周），挑取上面的单菌落摇菌，仍然不能摇浑。

我实在是找不到原因了，无奈啊，希望知道方法的同道帮帮忙啊，O(∩_∩)O谢谢啦

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1楼 2013-03-19 14:25:30

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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-20 16:25:10
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-03-21 11:27:51

你若是抗性什么都没问题的话，这应该属于你的质粒在大肠杆菌中不稳定的现象。你的插入片段应该不大吧你先把你之前的菌液PCR鉴定下看还有没有质粒。另外，你摇了多久没有摇浑浊？有没超过18小时？你可以一直摇着，看什么时候能摇起来，摇起来之后菌液PCR鉴定下，看是不是有你的质粒。若是有，那就是所谓的有毒性，在大肠里不稳定了。若是这样，你可以试着在较低的温度如30度下摇摇，不过时间至少也要18小时左右才行。也可以换宿主菌试下。我构的病毒载体就是这样不稳定的，很烦人，拷贝数好低，质粒浓度上不去。想死的心都有。