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liuxiuaza

金虫 (正式写手)

[求助] ChIP实验 已有2人参与

本人刚开始做ChIP实验，实验中阴性对照组、不加抗体组和实验组一样都出现了阳性条带，而且Input cotrol样品的条带相对暗很多，现在不知道从哪里分析了，是哪里出了问题？还请各位高手指点

[ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:34 ]
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实验求助

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1楼 2013-03-18 12:50:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hy_sandra at 2013-03-18 21:49:09
你的陰性對照組用的是什麼，怎麼會有不加抗體組，通常不加抗體的只有input，又ip用的是什麼beads，也許你說清楚點，才能幫你

阴性抗体是用的别的无关抗体，因为阴性抗体组也出现了阳性条带，我不知道是什么原因，就不加抗体也做了一遍，结果也出现了阳性条带，IP我用的是santa Cruz的Protein A/G PLUSAgarose。我是先用1%的甲醛进行交联，然后加甘氨酸终止，加裂解液然后超声，超声后的样品取上清，取一定蛋白浓度的样品加Protein A/G PLUSAgarose进行Preclear除去非特异性的蛋白，离心取上清加抗体过夜，再加Protein A/G PLUSAgarose进行沉淀，对沉淀复合物洗涤后，加洗脱缓冲液洗脱并解交联，离心取得上清是我的样品，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。还请您多多指点，在下先谢过了，不胜感激！
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3楼2013-03-19 08:53:47
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jk_xdx

银虫 (小有名气)
应该补充一点，超声的时候别超得太碎了，如果超得太过了，PCR扩增的循环数就得增加，这样得到的数据准确性比较差；另外出带很常见，只是它们的亮度应该差很多才对。
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8楼2013-03-21 16:59:21
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza: 金币+3 2013-03-19 08:54:02
你的陰性對照組用的是什麼，怎麼會有不加抗體組，通常不加抗體的只有input，又ip用的是什麼beads，也許你說清楚點，才能幫你

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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科研是無止盡的
2楼2013-03-18 21:49:09
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
liuxiuaza: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-19 12:25:22
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-03-21 11:18:31
liuxiuaza: 金币+1 2013-03-22 08:45:44
???E???????????]????????}??????????c???????]?????????????w?????IgG???????????????rat?????????rat IgG, ???^?v??@??????????F?l????????????????S?????????magnetic beads???u?u??????y??agarose beads????????????^??Q??chip??????е?????К?????????????????????F??]??phenol chloroform????DNA????????????r?????К??????@??sample?g???`???????????

[ ????????? http://muchong.com/3g ]
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科研是無止盡的
4楼2013-03-19 11:43:13
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hy_sandra at 2013-03-19 11:43:13
步驟大致上看起?頉]有太大的問題，但是有幾點是可以考慮的。第一，陰性抗體最好用IgG，如果你的一抗是?膔at?淼模陀胷at IgG, 不過縱使這樣，還是會出現條帶，只是相對弱了許多。第二，目前magnetic beads已?u?u取 ...

十分感谢您的指点
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5楼2013-03-19 12:27:44
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细胞-cell

新虫 (初入文坛)
请问你是做酵母的还是什么细胞的CHIP呀？老板最近也叫我做酵母的CHIP，能否请教您一些问题呢？
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6楼2013-03-20 22:19:37
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 细胞-cell at 2013-03-20 22:19:37
请问你是做酵母的还是什么细胞的CHIP呀？老板最近也叫我做酵母的CHIP，能否请教您一些问题呢？

我做的是一个癌细胞的，我对这个也不是很了解，现在遇到了一些问题，还不知道怎么解决！不过我倒是有些酵母的资料，可以给你
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7楼2013-03-21 08:42:34
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-03-21 16:59:21
应该补充一点，超声的时候别超得太碎了，如果超得太过了，PCR扩增的循环数就得增加，这样得到的数据准确性比较差；另外出带很常见，只是它们的亮度应该差很多才对。

是的，不过现在的情况是，阴性对照比实验组的条带要亮，也不知道哪里出了问题，是不是琼脂糖Beads特异性不好还是我选取的目的蛋白特异性不好？
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9楼2013-03-22 08:44:49
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圈圈媛媛

铁虫 (初入文坛)
我近期准备做这个实验，但是之前实验室没人做过，所以有很多不明白的地方想请教，请问你说的条带是沉淀物中的蛋白进行western检测的条带么？
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10楼2013-03-22 21:54:11
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