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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切

一个片段加上 spe1 xbal 双连个酶切位点后,连到载体上,在用这两个酶进行双酶切,切不开怎么办,片段测序后,酶切位点没有发生突变!
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硕士毕业去找工作
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:10
引用回帖:
6楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-03-14 10:12:19
甲基化了怎么办啊...

有两个解决方案:
1. 重新设计引物,把XbaI位点的甲基化位点突变掉

2. 把这个质粒转到甲基化酶敲除的大肠杆菌中,比如JM110,提取非甲基化的质粒再做酶切
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2013-03-14 10:25:41
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-13 20:04:10
amisking: 回帖置顶 2013-03-13 20:04:12
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:32
1.确定酶是正常的,切别的试试能不能切开。
2.查看在酶切位点及周围上有没有甲基化位点。我们有一次用BamHI,就发现转化到大肠杆菌中再提出来的质粒,怎么也切不开了。后来发现是BamHI和旁边临近的几个碱基形成了一个甲基化位点,导致切不开了。
2楼2013-03-13 16:57:52
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-13 20:04:17
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:42
看看XbaI的位点前后有没有GA和TC,就是这样的序列,GA TCTAGA TC,切不开,可能是XbaI被甲基化了
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-03-13 18:46:56
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流! 2013-03-13 20:04:24
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:50
有不會甲基化的competent cell可供製備載體用,忘了是那一種了,搜尋一下應可找到
科研是無止盡的
4楼2013-03-13 19:35:44
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