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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切

一个片段加上 spe1 xbal 双连个酶切位点后，连到载体上，在用这两个酶进行双酶切，切不开怎么办，片段测序后，酶切位点没有发生突变！
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硕士毕业去找工作
1楼 2013-03-13 16:51:49
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-13 20:04:10
amisking: 回帖置顶 2013-03-13 20:04:12
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:32
1.确定酶是正常的，切别的试试能不能切开。
2.查看在酶切位点及周围上有没有甲基化位点。我们有一次用BamHI，就发现转化到大肠杆菌中再提出来的质粒，怎么也切不开了。后来发现是BamHI和旁边临近的几个碱基形成了一个甲基化位点，导致切不开了。
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2楼2013-03-13 16:57:52
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-03-13 20:04:17
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:42
看看XbaI的位点前后有没有GA和TC，就是这样的序列，GA TCTAGA TC，切不开，可能是XbaI被甲基化了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-03-13 18:46:56
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-03-13 20:04:24
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:50
有不會甲基化的competent cell可供製備載體用，忘了是那一種了，搜尋一下應可找到
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科研是無止盡的
4楼2013-03-13 19:35:44
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 16:57:52
1.确定酶是正常的，切别的试试能不能切开。
2.查看在酶切位点及周围上有没有甲基化位点。我们有一次用BamHI，就发现转化到大肠杆菌中再提出来的质粒，怎么也切不开了。后来发现是BamHI和旁边临近的几个碱基形成了一 ...

咋看甲基化位点啊，如果甲基化了怎么办啊
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硕士毕业去找工作
5楼2013-03-14 10:08:36
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-13 18:46:56
看看XbaI的位点前后有没有GA和TC，就是这样的序列，GA TCTAGA TC，切不开，可能是XbaI被甲基化了

甲基化了怎么办啊
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硕士毕业去找工作
6楼2013-03-14 10:12:19
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
碧海行帆: 金币+2 2013-03-14 10:53:10
引用回帖:
6楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-03-14 10:12:19
甲基化了怎么办啊...

有两个解决方案：
1. 重新设计引物，把XbaI位点的甲基化位点突变掉

2. 把这个质粒转到甲基化酶敲除的大肠杆菌中，比如JM110，提取非甲基化的质粒再做酶切
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2013-03-14 10:25:41
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