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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有人用NADPH做过实验吗
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)

[求助] 有人用NADPH做过实验吗已有1人参与

我想做一种酶的活性检测，可是这种酶测活性需要NADPH,我购买的是NADPH-Na4，粉末状，具体测活性的话该怎么配置，怎么加呢？购买的NADPH粉末量很少，估计只能溶解后再做实验。有没有做过的，指点一下啊
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1楼2013-03-03 12:55:33
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流和应助！ 2013-03-17 22:25:27
NADPH是辅酶，终浓度为2-5mM就可以了，我经常做酶活检测，我们都是投反应，测酶活。氧化还原酶都需要这些辅酶，
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2楼2013-03-03 17:22:34
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-03 17:22:34
NADPH是辅酶，终浓度为2-5mM就可以了，我经常做酶活检测，我们都是投反应，测酶活。氧化还原酶都需要这些辅酶，

你测得是NADPH的减少量吗
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3楼2013-03-03 18:12:32
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你是用酶标仪测340nm的OD值变化吗？我们也做过，不过大部分都是直接看底物的生成，直接送HPLC
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4楼2013-03-03 18:38:51
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kabuqinuo89: 金币+2 2013-03-04 10:58:56
如果你加的是NADPH来反应测酶活，OD肯定是变低的，因为NADPH在340nm有吸收峰，而反应后的NADP+没有吸收峰，因而如果酶参加了反应，OD肯定是降低的。通过公式可以计算酶活。
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5楼2013-03-03 18:44:00
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-03 18:44:00
如果你加的是NADPH来反应测酶活，OD肯定是变低的，因为NADPH在340nm有吸收峰，而反应后的NADP+没有吸收峰，因而如果酶参加了反应，OD肯定是降低的。通过公式可以计算酶活。

我现在就是测NADPH得减少量，可是我的反应再不加酶的情况下，单独只有NADPH的话OD值是不变的，可是只要一加入底物，OD值就一直飙升，我也不知道是为什么 求解啊
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6楼2013-03-04 10:58:48
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kabuqinuo89: 金币+1 2013-03-06 10:35:29
做个不加酶，加底物和其他试剂看看OD值有什么变化（增加对照试验）。我们实验室做的一般只要是加了NADPH，如果反应了，OD肯定是下降的。
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7楼2013-03-04 20:41:16
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李艳君2011

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89: 金币+1 2013-03-06 10:35:34
NADPH不稳定啊，放那时间长了，值就会降低。建议投还原的实验，用NADP生成NADPH。看OD340的生成
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8楼2013-03-05 09:58:34
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lishaohe at 2013-03-04 20:41:16
做个不加酶，加底物和其他试剂看看OD值有什么变化（增加对照试验）。我们实验室做的一般只要是加了NADPH，如果反应了，OD肯定是下降的。

你们做实验的缓冲液是什么呢  我用的Tris-Hcl还好，OD不会变。可是用磷酸钾的话OD就会降低，不知道怎么回事。你们用的什么缓冲液呢
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9楼2013-03-06 10:35:17
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

Tris-HCl和PB都做过。一般都是用PB，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠
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10楼2013-03-06 22:12:12
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