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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药物分析 » 【求助】肝微粒体不代谢--急死人啦
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gentledragon

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】肝微粒体不代谢--急死人啦 已有5人参与

求教肝微粒体体外代谢实验问题：
我从sigma订购的鼠肝微粒体M9066，NADPH，按照文献报道的方法试验却发现检测不到代谢产物，底物量也不见减少。请同道中人指教，不胜感激！
为了鉴定乌头碱的体外代谢产物，0.5ml反应体系含150mM Tris-HCl 缓冲液（pH=7.4），5mM MgCl2， 1mg/ml 微粒体蛋白和40uM乌头碱，反应体系在37度预孵育3分钟后，向体系中加入50uL NADPH（20mM/L）启动反应，震荡水浴上孵育60分钟，而后向体系中加入4mL冰冷的二氯甲烷终止反应，涡旋震荡后4500g离心10分钟，取有机相3.5mL氮气吹干，而后用250uL流动相溶解进样。
按此法操作后，并未像文献中报道的那样发生代谢，而后改进缓冲液，即向缓冲液中加入甘油/EDTA/DTT，仍未见代谢发生，又有人说向体系中饱和氧气会好些，依法做后仍未见代谢，遂求高人指教！
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风一样的u然自得
1楼 2010-01-08 13:06:13
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gentledragon

金虫 (正式写手)
2楼2010-01-08 13:48:20
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liupps

木虫 (正式写手)
★ ★
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karl2100(金币+1,VIP+0):3Q 1-9 14:03
没有代谢物,那原形的量有没有变化？
还有建议你不要用二氯甲烷终止，加乙腈终止后，用流动相稀释后就进样
赞一下(11人) 回复此楼
3楼2010-01-08 18:22:15
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ronaldoli198311

至尊木虫 (正式写手)
微粒体没有活性？
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4楼2010-01-09 15:45:04
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gentledragon

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liupps at 2010-1-8 18:22:
没有代谢物,那原形的量有没有变化？
还有建议你不要用二氯甲烷终止，加乙腈终止后，用流动相稀释后就进样

加入二氯甲烷除了能萃取外还能出去孵化体系中的基质背景干扰物质，这种生物样品是比较脏的，而且色谱B的文章做得和本实验目前做的内容完全一样，用二氯甲烷能够萃取出底物和代谢物。
所以还请指出可能的导致实验失败的问题。
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风一样的u然自得
5楼2010-01-12 21:31:30
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woniu023

新虫 (初入文坛)
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karl2100(金币+1,VIP+0):谢谢回贴！ 1-19 20:48
自制肝微粒体不行吗？我也是做药物代谢的，肝微粒体都是自己制备，检测活性之后就加药代谢，制备完毕马上进行代谢实验，活性还是没问题的
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gentledragon
6楼2010-01-13 09:04:33
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gentledragon

金虫 (正式写手)
微粒体和NADPH均是购自sigma，但是我看到sigma的NADPH有几种不同的产品，难道是买的不对么？
β-Nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate reduced tetrasodium salt hydrate
和这个
β-Nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate reduced tetrasodium salt hydrate
只是后一个含结晶水啊，我的实验究竟错在哪里呢？
指点一下啊，拜托
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风一样的u然自得
7楼2010-01-19 15:12:01
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xiangfei218

铜虫 (初入文坛)
★
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肝粒酶自制如何制备，能解释详细点吗？谢谢
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爱拼才会赢
8楼2010-09-02 11:37:55
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想想和凯旋门

新虫 (初入文坛)
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karl2100(金币+1):谢谢回复！ 2010-09-16 00:25:43
肝微粒体的自制很多文献都有详细步骤，需要低温的超高速离心机。
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9楼2010-09-15 22:01:50
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bellawang

银虫 (初入文坛)
★
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要确定微粒体是不是好的，之前也遇到过这样的问题，最后就是微粒体的问题
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每天进步一点点
10楼2010-09-15 22:31:08
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