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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除中maker的方向，求討論
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daniel_tang

金虫 (小有名气)

[交流] 基因敲除中maker的方向，求討論

基因敲除方法，比較常用的是這篇文章吧
Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 6640-6645 (2000).

E. coli 的Keio collecton 用也是這個方法。

基因敲除�?際上是同源重組中，用maker (抗生素基因) 去替換目標基因。我的問題是，在設計primer的時候，marker的方向有需要特別設計的嗎？

上面提到的方法和Keio裡面，marker和目標基因的方向是一致的。那麼如果方向相反會怎麼樣呢？有paper討論這個東西的嗎？

希望瞭解的童鞋?碛懻撓隆�
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1楼2013-01-31 16:14:15
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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daniel_tang: 金币+2 2013-02-01 10:42:12
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-02-01 10:54:27
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。
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2楼2013-02-01 02:38:20
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sumoeric

金虫 (小有名气)
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daniel_tang: 金币+1 2013-02-01 13:00:33
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-01 02:38:20
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。

顶一下楼上，我也是做这方面的，之前也挺烦的，其实就像楼上说的同启动子有关，只要有启动子就不用考虑方向
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3楼2013-02-01 07:50:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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daniel_tang: 金币+3 2013-02-01 13:00:51
一般是需要筛选基因与敲除基因方向一致，否则，由于筛选基因自身有启动子，反方向插入可能造成互补链DNA的表达。
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4楼2013-02-01 07:57:28
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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反正最后插入的marker要删掉的，一般来说表达点其他基因无所谓，不过筛选使用的抗生素最好用CM/KM这种可信度比较好的，不要用Amp/Tet啥的。。 最后看表型一般是看loop out的菌株的。
除非你要敲的对象基因致死  或者附近有影响生长的基因啥的。
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5楼2013-02-01 11:05:36
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daniel_tang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-01 02:38:20
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。

恩，我知道marker是帶promoter的，理論上不論方向，都能表達。我就想知道其中有沒有差別。

比如4樓提到“反方向插入可能造成互补链DNA的表达”

另外，按keio的構建方法，start codon留下?砹耍屈N被敲的那個基因的pomoter應該能啟動整個marker (e.g. FRT-Km-FRT cassette)的表達，會產生一條很長的peptide，這樣會不會涉及到密碼子錯位之�?的問題？還是說這些都沒有什麼關係，不用考慮。不知你怎麼看？
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6楼2013-02-01 13:00:16
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daniel_tang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-01 07:57:28
一般是需要筛选基因与敲除基因方向一致，否则，由于筛选基因自身有启动子，反方向插入可能造成互补链DNA的表达。

“反方向插入可能造成互补链DNA的表达”

這個觀點很有說服力，想問下有人研究過這個嗎？有沒有paper討論marker的方向的？
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7楼2013-02-01 13:13:13
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Haibara_Ai

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daniel_tang: 金币+2 2013-02-01 23:12:06
只有marker的promoter（medium强度的promoter）影响外面表型，所以最后要敲掉，纠结外面的启动子影响没有意义，多表达那点东西99.99%也不会对筛选有影响（离启动子远端的基因表达水平越远越低，而且一般构建marker会带一个简单的terminater吧）。
敲多少，是否敲启动子，是否敲startcodon，是否要inframe是根据你的实验目的决定的（比如一个启动子后面好几个ORF之类的），而不是根据paper决定的
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8楼2013-02-01 22:07:54
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daniel_tang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-01 22:07:54
只有marker的promoter（medium强度的promoter）影响外面表型，所以最后要敲掉，纠结外面的启动子影响没有意义，多表达那点东西99.99%也不会对筛选有影响（离启动子远端的基因表达水平越远越低，而且一般构建marker会 ...

?K不是說在糾結什麼，剛入門，最近在做敲除，�?驗也成功了，用的是同方向，只是好奇如果反過?頃心男┎顒e，又不是很懂，所以想問問。
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9楼2013-02-01 23:31:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by daniel_tang at 2013-02-01 13:13:13
“反方向插入可能造成互补链DNA的表达”

這個觀點很有說服力，想問下有人研究過這個嗎？有沒有paper討論marker的方向的？...

不知道有没有人研究过，不过投稿的时候如果插的方向反了有些reviewer会提出质疑。我觉得主要是这个原因，为了减少可能出现的麻烦，所以总是正向插入的。
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10楼2013-02-02 12:59:04
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