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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除中maker的方向，求討論
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daniel_tang

金虫 (小有名气)

[交流] 基因敲除中maker的方向，求討論

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Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 6640-6645 (2000).

E. coli ??Keio collecton ??????@????????

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1楼 2013-01-31 16:14:15
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
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daniel_tang: 金币+2 2013-02-01 23:12:06
只有marker的promoter（medium强度的promoter）影响外面表型，所以最后要敲掉，纠结外面的启动子影响没有意义，多表达那点东西99.99%也不会对筛选有影响（离启动子远端的基因表达水平越远越低，而且一般构建marker会带一个简单的terminater吧）。
敲多少，是否敲启动子，是否敲startcodon，是否要inframe是根据你的实验目的决定的（比如一个启动子后面好几个ORF之类的），而不是根据paper决定的
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8楼2013-02-01 22:07:54
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
daniel_tang: 金币+2 2013-02-01 10:42:12
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-02-01 10:54:27
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。
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2楼2013-02-01 02:38:20
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sumoeric

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
daniel_tang: 金币+1 2013-02-01 13:00:33
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-01 02:38:20
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。

顶一下楼上，我也是做这方面的，之前也挺烦的，其实就像楼上说的同启动子有关，只要有启动子就不用考虑方向
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3楼2013-02-01 07:50:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
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daniel_tang: 金币+3 2013-02-01 13:00:51
一般是需要筛选基因与敲除基因方向一致，否则，由于筛选基因自身有启动子，反方向插入可能造成互补链DNA的表达。
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4楼2013-02-01 07:57:28
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