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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除中maker的方向，求討論
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daniel_tang

金虫 (小有名气)

[交流] 基因敲除中maker的方向，求討論

基因敲除方法，比較常用的是這篇文章吧
Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 6640-6645 (2000).

E. coli 的Keio collecton 用也是這個方法。

基因敲除�?際上是同源重組中，用maker (抗生素基因) 去替換目標基因。我的問題是，在設計primer的時候，marker的方向有需要特別設計的嗎？

上面提到的方法和Keio裡面，marker和目標基因的方向是一致的。那麼如果方向相反會怎麼樣呢？有paper討論這個東西的嗎？

希望瞭解的童鞋?碛懻撓隆�
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1楼2013-01-31 16:14:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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daniel_tang: 金币+3 2013-02-01 13:00:51
一般是需要筛选基因与敲除基因方向一致，否则，由于筛选基因自身有启动子，反方向插入可能造成互补链DNA的表达。
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4楼2013-02-01 07:57:28
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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daniel_tang: 金币+2 2013-02-01 10:42:12
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-02-01 10:54:27
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。
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2楼2013-02-01 02:38:20
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sumoeric

金虫 (小有名气)
★ ★
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daniel_tang: 金币+1 2013-02-01 13:00:33
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-01 02:38:20
敲除基因时侯， 根据operon，有时候是连着promoter一起敲掉的
marker自带constitutive promoter 不需要考虑方向。

顶一下楼上，我也是做这方面的，之前也挺烦的，其实就像楼上说的同启动子有关，只要有启动子就不用考虑方向
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3楼2013-02-01 07:50:09
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
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反正最后插入的marker要删掉的，一般来说表达点其他基因无所谓，不过筛选使用的抗生素最好用CM/KM这种可信度比较好的，不要用Amp/Tet啥的。。 最后看表型一般是看loop out的菌株的。
除非你要敲的对象基因致死  或者附近有影响生长的基因啥的。
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5楼2013-02-01 11:05:36
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