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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后切胶回收
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by yuguiyan at 2013-01-24 22:23:33
我怎么觉得是酶的问题呢，试试延长酶切时间吧

我第一次做的基因是500多bp，挺顺利的，应该不是酶的问题吧，酶切时间都5小时了……用的fermentas的酶
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21楼2013-01-25 15:20:01
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fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2013-01-26 18:08:41
我今天双酶切5管放在一起回收，这是这次回收的电泳图，大家帮忙看看这种亮度能做连接吗？

2013-1-26酶切回收.jpg
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22楼2013-01-26 18:08:25
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fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2013-01-26 18:12:15
忘了说了，片段大小是300多bp，marker是2000的，顺序：2000、1000、750、500、250、100.

2013-1-26.jpg
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23楼2013-01-26 18:11:57
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
fayzhao: 金币+1 2013-01-30 13:12:50
20ul的连接体系，除了酶、载体、buffer，其余都用产物补足，载体的浓度够的话加1~2ul就够了
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你的日子如何，你的力量也必如何！
24楼2013-01-28 11:03:19
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alisayan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
fayzhao: 金币+5 2013-01-30 13:16:40
我之前也做过约300bp的片段的克隆，确实比较难做，我建议你可以用PCR的方法，多P几管，再双酶切回收，去连到你的表达载体上，如果像现在这样从现在的载体上酶切得到的目的片段，本来浓度就低，再加上小片段回收效率低点，就更回收不到目的片段了。
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付出必有回报
25楼2013-01-28 14:26:10
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by alisayan at 2013-01-28 14:26:10
我之前也做过约300bp的片段的克隆，确实比较难做，我建议你可以用PCR的方法，多P几管，再双酶切回收，去连到你的表达载体上，如果像现在这样从现在的载体上酶切得到的目的片段，本来浓度就低，再加上小片段回收效率 ...

你是说不用克隆，直接PCR之后双酶切吗？PCR之后要不要先回收再酶切呢？还有就是PCR产物双酶切的话，怎么判断它有没有切开呀？
O(∩_∩)O谢谢啦
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26楼2013-01-30 13:14:34
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
fayzhao: 金币+2 2013-01-30 14:14:55
看了你的实验结果，感觉你的酶切效率不高。kpnI 和Bgl II做双酶切时要同时考虑两种酶的活性，采用合适的buffer。fermentas的kpn I 酶活性并不高，并需要使用其公司特制的buffer，具体请见链接（http://www.thermoscientificbio.c ... estriction-enzymes/）。这种情况下最好是采用分步酶切法，即先用一种酶在适宜buffer下酶切一段时间，之后用PCR纯化试剂盒（axygen的就可以）回收DNA，之后加入另一种酶和buffer再酶切一定时间。
另外关于你的酶切体系里4ul 的总酶量过多，通常1小时消化1ugDNA只需要1unit的酶，大多数市售内切酶是10units/ul的，消化时1ul即可。内切酶在储存时需要加入50%的甘油，而酶切体系中甘油的比例超过10%就可以完全抑制内切酶的活性。按照你的酶切体系计算，4ul 的内切酶就会为总体系带入5%的甘油，一定会对DNA的消化造成影响。建议内切酶的量只占体系总量的5%，并不是越多越好。
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27楼2013-01-30 14:01:48
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by mascotte at 2013-01-30 14:01:48
看了你的实验结果，感觉你的酶切效率不高。kpnI 和Bgl II做双酶切时要同时考虑两种酶的活性，采用合适的buffer。fermentas的kpn I 酶活性并不高，并需要使用其公司特制的buffer，具体请见链接（http://www.thermosc ...

我试过分步酶切，但是没有这种双酶切体系的结果好，所以最后我采用的是双酶切。1ugDNA只需要1unit的酶吗？我看到的是说1ugDNA需要1ul的酶呀，并且我用这个体系进行酶切的时候，5小时才能切完啊……
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28楼2013-01-30 14:14:49
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mascotte

金虫 (正式写手)
单位酶活力的定义就是完全消化1ug lamda DNA所需要的酶量，通常是10倍过量消化的，即1ul。
你的的双酶切buffer是什么？
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29楼2013-01-30 14:43:48
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by mascotte at 2013-01-30 14:43:48
单位酶活力的定义就是完全消化1ug lamda DNA所需要的酶量，通常是10倍过量消化的，即1ul。
你的的双酶切buffer是什么？

buffer是1Xtango。我用的fermentas的酶
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30楼2013-01-30 16:14:17
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