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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后切胶回收
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fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后切胶回收

各位虫友好：
目前，我正在做质粒双酶切，体系40ul：
dd水                       补足40ul
10Xtango buffer     4ul
质粒                       2ug
kpnI                        2ul
bglII                        2ul
37℃反应5h,电泳检测图如下：

目的是为了回收目的条带（300多bp），切胶回收用了takara的和axygen的，都没有回收到，跑胶没有任何条带。接下来我要做的是将目的基因连接到表达载体中，回收不到怎么办哪？求帮助！！！

2013-1-20双酶切_副本.jpg
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1楼 2013-01-23 17:10:19
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by mascotte at 2013-01-30 14:01:48
看了你的实验结果，感觉你的酶切效率不高。kpnI 和Bgl II做双酶切时要同时考虑两种酶的活性，采用合适的buffer。fermentas的kpn I 酶活性并不高，并需要使用其公司特制的buffer，具体请见链接（http://www.thermosc ...

我试过分步酶切，但是没有这种双酶切体系的结果好，所以最后我采用的是双酶切。1ugDNA只需要1unit的酶吗？我看到的是说1ugDNA需要1ul的酶呀，并且我用这个体系进行酶切的时候，5小时才能切完啊……
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28楼2013-01-30 14:14:49
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-23 18:55:12
fayzhao: 金币+1 2013-01-23 18:55:27
你得把marker的条带标出来。和提质粒一样，最后一步洗脱之前的酒精去除比较重要。切胶时不要切太多无用胶进去，影响回收效率。之前我也遇到过这个问题，提高浓度比较重要
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我还年轻，我要上路！
2楼2013-01-23 17:55:50
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fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2013-01-23 18:54:47
补充：marker条带分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp
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3楼2013-01-23 18:54:39
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 转基因猴子 at 2013-01-23 17:55:50
你得把marker的条带标出来。和提质粒一样，最后一步洗脱之前的酒精去除比较重要。切胶时不要切太多无用胶进去，影响回收效率。之前我也遇到过这个问题，提高浓度比较重要

我把产物全部进行回收，回收胶在切胶的紫外下都看不到目的条带了……基本都没法切，最后我还是切了，最后检测什么也没有回收到。
那你最后怎么解决的呢？怎么提高浓度？提高质粒的浓度还是什么？谢谢啦
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4楼2013-01-23 18:58:07
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