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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后切胶回收
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fayzhao

金虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 11ychen at 2013-01-24 10:09:01
我在想，为何不把你需要的约300bp的片段先扩出来，再酶切、纯化，与载体相连。至少这样你需要的片段浓度就很合适啦。

我是扩增之后进行了T克隆测序的，测序正确的菌液提质粒进行双酶切的。你的意思是直接把PCR产物双酶切？
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11楼2013-01-24 10:24:39
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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fayzhao: 金币+1 2013-01-24 10:45:59
我觉得质粒条带很亮而且看上去有的不完全酶切的样子，可以把体系放大到50ul啊，多切几管，酶量我觉得应该够了，回收的时候尽量用大孔胶，把产物都放在一个或两个孔跑胶，切胶的时候把多余的胶都去掉，只留下有目的片段的胶。虽然图中的条带看起来不亮，但回收应该也是可以的。
我试过跑胶没条带也照常连接，把产物量增大，人品好的时候也没问题
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你的日子如何，你的力量也必如何！
12楼2013-01-24 10:26:09
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by qitianyang at 2013-01-24 10:14:11
从你的电泳图Marker和目的条带的宽度看，你用来跑目的条带的孔比较小。因为你的目的条带的量比较少，所以可以酶切的时候多切几管，配制大孔的Agrose胶，然后跑电泳的时候尽量都加到一个胶孔里，这样就可以增加每个胶 ...

我这个是检测图，后面切胶回收的时候用的是大孔……
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13楼2013-01-24 10:38:42
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fayzhao

金虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by sxxuan at 2013-01-24 10:26:09
我觉得质粒条带很亮而且看上去有的不完全酶切的样子，可以把体系放大到50ul啊，多切几管，酶量我觉得应该够了，回收的时候尽量用大孔胶，把产物都放在一个或两个孔跑胶，切胶的时候把多余的胶都去掉，只留下有目的片 ...

50ul体系的时候用的酶也是2ul吗？质粒呢？我用的40ul,体系我都写了，50ul体系是相应放大？
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14楼2013-01-24 10:48:18
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
fayzhao: 金币+4 2013-01-24 12:26:59
引用回帖:
14楼: Originally posted by fayzhao at 2013-01-24 10:48:18
50ul体系的时候用的酶也是2ul吗？质粒呢？我用的40ul,体系我都写了，50ul体系是相应放大？...

其实酶量不用很大的，当然这要与质粒的量相关。酶量最好不要超过体系的1/10，否则甘油的浓度会影响酶切效率。
50ul体系中我一般只用1~2ul的酶
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15楼2013-01-24 12:02:54
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by sxxuan at 2013-01-24 12:02:54
其实酶量不用很大的，当然这要与质粒的量相关。酶量最好不要超过体系的1/10，否则甘油的浓度会影响酶切效率。
50ul体系中我一般只用1~2ul的酶...

你能不能把你用的50ul体系给我发一下参考呢？O(∩_∩)O谢谢
这种情况下一般做几管才够回收的量呢？
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16楼2013-01-24 12:27:54
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠
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世界上只有一种真正的英雄主义，那就是看清生活的真相之后，依然热爱生活。
17楼2013-01-24 18:03:17
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我怎么觉得是酶的问题呢，试试延长酶切时间吧
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18楼2013-01-24 22:23:33
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2013-01-25 15:24:50
你这个问题可以从以下方法去解决：1、酶切时加大质粒的量；2、酶切时多切几管然后一起回收，量就增加了。我以前经常这样干的。
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19楼2013-01-25 11:53:48
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
fayzhao: 金币+3 2013-01-25 15:26:57
引用回帖:
16楼: Originally posted by fayzhao at 2013-01-24 12:27:54
你能不能把你用的50ul体系给我发一下参考呢？O(∩_∩)O谢谢
这种情况下一般做几管才够回收的量呢？...

质粒     10~20ul
酶       各1ul，若质粒浓则可加至2ul
buffer      5ul
补水至50ul
一般来说两管就足够了。我是从三千多的质粒中切100bp左右的条带，切下来也是很弱，会根据质粒的浓度来调整加入质粒的量。
若质粒太浓，则稀释10倍再按上述体系
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你的日子如何，你的力量也必如何！
20楼2013-01-25 13:41:27
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