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fayzhao

金虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
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虫号: 1573744
注册: 2012-01-11
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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 双酶切后切胶回收

各位虫友好：
目前，我正在做质粒双酶切，体系40ul：
dd水                      补足40ul
10Xtango buffer    4ul
质粒                      2ug
kpnI                      2ul
bglII                      2ul
37℃反应5h,电泳检测图如下：

目的是为了回收目的条带（300多bp），切胶回收用了takara的和axygen的，都没有回收到，跑胶没有任何条带。接下来我要做的是将目的基因连接到表达载体中，回收不到怎么办哪？求帮助！！！

2013-1-20双酶切_副本.jpg

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1楼2013-01-23 17:10:19

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mascotte

金虫 (正式写手)

应助: 10 (幼儿园)
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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
fayzhao: 金币+2 2013-01-30 14:14:55

看了你的实验结果，感觉你的酶切效率不高。kpnI 和Bgl II做双酶切时要同时考虑两种酶的活性，采用合适的buffer。fermentas的kpn I 酶活性并不高，并需要使用其公司特制的buffer，具体请见链接（http://www.thermoscientificbio.c ... estriction-enzymes/）。这种情况下最好是采用分步酶切法，即先用一种酶在适宜buffer下酶切一段时间，之后用PCR纯化试剂盒（axygen的就可以）回收DNA，之后加入另一种酶和buffer再酶切一定时间。
另外关于你的酶切体系里4ul 的总酶量过多，通常1小时消化1ugDNA只需要1unit的酶，大多数市售内切酶是10units/ul的，消化时1ul即可。内切酶在储存时需要加入50%的甘油，而酶切体系中甘油的比例超过10%就可以完全抑制内切酶的活性。按照你的酶切体系计算，4ul 的内切酶就会为总体系带入5%的甘油，一定会对DNA的消化造成影响。建议内切酶的量只占体系总量的5%，并不是越多越好。