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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[交流] 引物设计 已有4人参与

我想从质粒中获取一段基因序列，设计引物（加酶切位点）
我该如何设计引物？
会不会导致出现扩增错误？如何提高试验的保真性？
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1楼 2013-01-19 16:27:09
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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这样说太笼统啦，你可以把什么质粒告诉大家，你自己可以先按自己的理解设计一对引物放上来，大家看看可不可行啊。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2013-01-19 16:35:45
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2013-01-19 16:35:45
这样说太笼统啦，你可以把什么质粒告诉大家，你自己可以先按自己的理解设计一对引物放上来，大家看看可不可行啊。

先前已经把目的基因（一段启动子序列）从植物cDNA文库中筛选出来（两端有酶切位点），连接在pMD18-T上。
   现在想换掉这两个酶切位点，改用其他的酶切位点。
用什么方式比较好呢？不会丢失碱基或错配
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3楼2013-01-19 16:42:48
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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你把原来的引物换个酶切位点不就完了吗？怎么会错配呢？
肯定不会有问题。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
4楼2013-01-19 17:53:38
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2013-01-19 17:53:38
你把原来的引物换个酶切位点不就完了吗？怎么会错配呢？
肯定不会有问题。

你是说再重新从cDNA中PCR？
还是再质粒上PCR？不会有错配吗？需要用高保真Taq酶么？
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5楼2013-01-19 18:02:16
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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用质粒为模板就可以了。质粒几千bp，一般是不会有错配而导致非特意扩增的，只有基因组才会有这种可能。
有高保真酶就用高保真酶，片段不太长的话，没有也可以。
但不管用什么酶，克隆完后都需要测序验证。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
6楼2013-01-19 18:23:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引物设计时换成你想要的酶切位点就可以了。如果质粒里的序列是经测序验证过的话，直接从质粒里P比较好，因为模板相对简单容易控制。如果基因片段比较长的话最好用高保真酶P，不长的话无所谓，不过P的时候不要采用太多的循环数目。
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7楼2013-01-19 18:39:15
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yesali

木虫 (正式写手)
★
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设计引物时在引物的上游加入你的酶切位点，注意末端多加一到两个保护性碱基（便于直接多PCR产物进行酶切）。建议从质粒上P，使用普通酶即可。实在不放心，可测序验证
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8楼2013-01-19 21:19:18
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fdjr

金虫 (著名写手)
原来的引物换个酶切位点，应该问题不大…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2013-01-20 00:17:38
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
好的！！谢谢各位了
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10楼2013-01-20 08:43:23
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