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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[交流] 引物设计 已有4人参与

我想从质粒中获取一段基因序列,设计引物(加酶切位点)
我该如何设计引物?
会不会导致出现扩增错误?如何提高试验的保真性?
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


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这样说太笼统啦,你可以把什么质粒告诉大家,你自己可以先按自己的理解设计一对引物放上来,大家看看可不可行啊。
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2楼2013-01-19 16:35:45
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2013-01-19 16:35:45
这样说太笼统啦,你可以把什么质粒告诉大家,你自己可以先按自己的理解设计一对引物放上来,大家看看可不可行啊。

先前已经把目的基因(一段启动子序列)从植物cDNA文库中筛选出来(两端有酶切位点),连接在pMD18-T上。
   现在想换掉这两个酶切位点,改用其他的酶切位点。
用什么方式比较好呢?不会丢失碱基或错配
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3楼2013-01-19 16:42:48
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


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你把原来的引物换个酶切位点不就完了吗?怎么会错配呢?
肯定不会有问题。
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4楼2013-01-19 17:53:38
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2013-01-19 17:53:38
你把原来的引物换个酶切位点不就完了吗?怎么会错配呢?
肯定不会有问题。

你是说再重新从cDNA中PCR?
还是再质粒上PCR?不会有错配吗?需要用高保真Taq酶么?
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5楼2013-01-19 18:02:16
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


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用质粒为模板就可以了。质粒几千bp,一般是不会有错配而导致非特意扩增的,只有基因组才会有这种可能。
有高保真酶就用高保真酶,片段不太长的话,没有也可以。
但不管用什么酶,克隆完后都需要测序验证。
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6楼2013-01-19 18:23:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


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引物设计时换成你想要的酶切位点就可以了。如果质粒里的序列是经测序验证过的话,直接从质粒里P比较好,因为模板相对简单容易控制。如果基因片段比较长的话最好用高保真酶P,不长的话无所谓,不过P的时候不要采用太多的循环数目。
7楼2013-01-19 18:39:15
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yesali

木虫 (正式写手)


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设计引物时在引物的上游加入你的酶切位点,注意末端多加一到两个保护性碱基(便于直接多PCR产物进行酶切)。建议从质粒上P,使用普通酶即可。实在不放心,可测序验证
8楼2013-01-19 21:19:18
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fdjr

金虫 (著名写手)

原来的引物换个酶切位点,应该问题不大…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
9楼2013-01-20 00:17:38
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

好的!!谢谢各位了
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10楼2013-01-20 08:43:23
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