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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光探针
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jmren3361

铜虫 (正式写手)

[求助] 荧光探针

最近在学习荧光定量PCR，有几个不懂的地方请教大家：
TaqMan探针结合到模板上后，由于Taq酶的活性，被切割产生荧光
FRET、Molecular beacon、Scorpion primer结合到模板上后，是不是一直待在模板上？探针与模板的结合会不会影响PCR扩增？探针与模板的结合与PCR扩增是如何同步进行的？
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1楼 2013-01-08 14:50:42
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real-gold

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hqsinberg at 2013-01-09 13:04:45
Molecular beacon和TaqMan工作的原理不同。TaqMan是专一性结合在目的基因区域，是目的基因在延伸阶段产生荧光机型定量，双链状态下不发光。Molecular beacon是结合在引物上，引物一延伸就拉伸了Molecular beacon长 ...

你好， 请教一下疑问。
一般TaqMan探针法，体系里是一对引物加一条探针，最近看到有人的做法是，体系里还是一对引物但加进了两条探针（两条探针的荧光标记也是一样的），一直想不通这么做的用意是什么，这样还能定量定性吗？
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8楼2013-01-11 10:32:00
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是合成引物时一起合成上去的，不影响PCR
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shine
2楼2013-01-08 15:43:20
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-08 20:52:28
jmren3361: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-01-23 08:59:28
1. 探针不是一直待在模板上，在变性的时候也会解链，但由于探针的退火温度高（一般设计的时候会比引物的退火温度高10度以上），在引物还没有退火结合到模板上的时候，探针已经退火和模板结合了，因此探针和模板的结合程度高于引物。
2. 探针与模板的结合会不影响PCR扩增，因为PCR的时候已经有较稳定的探针-模板结合物
3. Taq酶的3'切割活性会在遇到探针-模板结合物的时候切割探针，使PCR继续下去
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3楼2013-01-08 20:11:06
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jmren3361

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-08 20:11:06
1. 探针不是一直待在模板上，在变性的时候也会解链，但由于探针的退火温度高（一般设计的时候会比引物的退火温度高10度以上），在引物还没有退火结合到模板上的时候，探针已经退火和模板结合了，因此探针和模板的结 ...

我还有一个疑问：
以Molecular beacon为例，当94度变性时，茎环结构被打开，此时即使探针未与模板结合，荧光基团和报告基团已经分离，产生荧光，如何做到实时定量？
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4楼2013-01-09 12:51:38
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