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jmren3361铜虫 (正式写手)
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荧光探针
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最近在学习荧光定量PCR，有几个不懂的地方请教大家： TaqMan探针结合到模板上后，由于Taq酶的活性，被切割产生荧光 FRET、Molecular beacon、Scorpion primer结合到模板上后，是不是一直待在模板上？探针与模板的结合会不会影响PCR扩增？探针与模板的结合与PCR扩增是如何同步进行的？ |
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zhang881007
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2楼2013-01-08 15:43:20
ccharlien
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1. 探针不是一直待在模板上，在变性的时候也会解链，但由于探针的退火温度高（一般设计的时候会比引物的退火温度高10度以上），在引物还没有退火结合到模板上的时候，探针已经退火和模板结合了，因此探针和模板的结合程度高于引物。 2. 探针与模板的结合会不影响PCR扩增，因为PCR的时候已经有较稳定的探针-模板结合物 3. Taq酶的3'切割活性会在遇到探针-模板结合物的时候切割探针，使PCR继续下去 |
3楼2013-01-08 20:11:06
jmren3361
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4楼2013-01-09 12:51:38
jmren3361
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5楼2013-01-09 12:52:30
hqsinberg
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6楼2013-01-09 13:04:45
hqsinberg
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7楼2013-01-09 13:12:29
8楼2013-01-11 10:32:00
hqsinberg
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【答案】应助回帖
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为了表达准确我来个外文的原文（麻烦自己翻译，以免别人的产生误解，原版的外文分子生物学，绝对错不了。）SYBR® Green monitors the total amount of double-stranded DNA but cannot dis-tinguish between different sequences. To be sure that the correct target sequence is being amplified a sequence specific fluorescent probe is needed. An example is theTaqMan® probe (Applied Biosystems, Foster City, CA). The TaqMan® probe consistsof two fluorophores linked by a DNA sequence that will hybridize to the middle of the target DNA. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) transfers the energy from the short-wavelength fluorophore on one end to the long wavelength fluorophore at the other end. This quenches the short wave emission. During PCR the TaqMan® probe binds to the target sequence after the denaturation step that separates the two DNA strands. As the Taq polymerase extends the primer during the next PCR cycle it will eventually bump into the TaqMan® probe.The Taq poly-merase is not only capable of displacing strands ahead of it but also has a 5‘-nuclease activity that degrades the DNA strand of the probe.This breaks the linkage between the two fluorophores and disrupts the FRET. The short-wavelength fluorophore is now free from quenching and its fluorescence increases. In this case the increase in fluorescence is directly related to the amount of the specific target sequence that has been amplified。 |
9楼2013-01-11 12:43:00
