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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 黑曲霉 提RNA 逆转录 PCR无片段
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qbin1304

新虫 (正式写手)

[求助] 黑曲霉 提RNA 逆转录 PCR无片段

根据NCBI上黑曲霉全基因组，设计了黑曲霉里几个蛋白的引物，通过提取RNA，逆转录，再PCR克隆我的目的片段。
但是做了好几次吗，每次我什么条带都克隆不出来。逆转录和PCR都没有问题，不知道是RNA提的不好呢，还是我引物设计的不合理，还是NCBI上公布的基因不适合我的菌，我对照了NCBI上两个菌株的全基因组，根据这两个里都有的设计的引物，求高人指教了。
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1楼 2013-01-05 22:09:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
qbin1304: 金币+1, ★有帮助 2013-01-06 10:22:46
首先，“蛋白的引物”的说法有问题。
你如果确定逆转录和PCR没有问题？是参比P出来了吗？
如果你怀疑RNA的质量，可以跑胶看带型，确定是否降解以。
引物设计是很重要的。你找的基因序列保守性如何？先不考虑intron的问题，你是否能用此引物以基因组DNA为模板P出相应的基因？如果可以P出来再考虑做逆转录从cDNA里P。
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2楼2013-01-06 01:56:52
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qbin1304

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 01:56:52
首先，“蛋白的引物”的说法有问题。
你如果确定逆转录和PCR没有问题？是参比P出来了吗？
如果你怀疑RNA的质量，可以跑胶看带型，确定是否降解以。
引物设计是很重要的。你找的基因序列保守性如何？先不考虑intr ...

谢谢了。逆转录用的是试剂盒里的control，准备提DNA看一下有没有我想要的片段。
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3楼2013-01-06 10:24:26
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