应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 要愁死了，求帮助，筛选转化子的问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
131/2返回列表12下一页
查看: 855  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

cdmmore

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 要愁死了，求帮助，筛选转化子的问题

将目的基因导入pET28a，选了8个单克隆做菌落PCR能P出来，但是提质粒后，用目的基因上的酶切位点酶切，居然切不断，大小和空质粒一样，怎么回事呀？我的目的基因到底有没有导进去？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-04 14:33:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

实习版主

Dreamer

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-04 15:50:21
一切以酶切结果为准，你是切不开呢，还是切开了，但是大小与空质粒一样，如果是后者的话，很明显，没有导进去，菌落PCR假阳性.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2013-01-04 15:17:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-04 15:50:33
菌落PCR有假阳性的，既然提质粒酶切鉴定不符合，肯定是不对的，要么多筛，要么从新克隆。
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-04 15:32:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2013-01-04 15:17:58
一切以酶切结果为准，你是切不开呢，还是切开了，但是大小与空质粒一样，如果是后者的话，很明显，没有导进去，菌落PCR假阳性.

是切不开。请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢，我挑了8个克隆都能P出来，但都切不开
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-04 15:49:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-04 15:32:52
菌落PCR有假阳性的，既然提质粒酶切鉴定不符合，肯定是不对的，要么多筛，要么从新克隆。

请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢？
赞一下 回复此楼
5楼2013-01-04 15:49:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-07 17:06:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-04 15:49:55
请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢？...

PCR是非常灵敏的技术，DNA模板量极少就可以扩增到通常的检测水平，所以任何PCR都可能出现假阳性的。比方说菌落PCR吧，一个细菌都可能能P出来的，你能保证试验中没有污染的菌源？做菌落PCR的时候要做阴性对照。很多人不喜欢做对照，事实上对照是非常重要的，实验可信性提高，而且出了问题也容易分析。
赞一下 回复此楼
6楼2013-01-05 08:18:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-04 15:49:47
是切不开。请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢，我挑了8个克隆都能P出来，但都切不开...

你做菌落PCR的时候是用的载体上的引物吗？最好有一个引物是克隆片段上的，一个在载体上，这样的话PCR的可信性非常高。
赞一下 回复此楼
7楼2013-01-05 08:35:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-05 08:35:22
你做菌落PCR的时候是用的载体上的引物吗？最好有一个引物是克隆片段上的，一个在载体上，这样的话PCR的可信性非常高。...

PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上，一个在载体上好呢？
赞一下 回复此楼
8楼2013-01-05 09:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ag6501

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
8楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-05 09:27:46
PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上，一个在载体上好呢？...

PCR的引物一般这样设：上游：载体-目标基因一段

                      下游：目标基因-载体一段
赞一下 回复此楼
阳光倾城！
9楼2013-01-05 11:26:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-07 17:06:41
引用回帖:
8楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-05 09:27:46
PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上，一个在载体上好呢？...

都在克隆片段上也可以，不过有可能出现克隆片段P出假阳性的可能。如果一个在载体上，一个在目的基因上，假阳性的概率变小，而且保证你筛选的质粒既含有载体又含有目的片段。当然，最好是是象9L那样设计。但是一般的情况是你有克隆目的片段的引物，载体有通用引物，所以我说的这种引物组合是现成的，不需要另行设计。
赞一下 回复此楼
10楼2013-01-05 12:49:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 cdmmore 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 265求调剂 +8 yelck 2026-04-01 9/450 2026-04-01 14:37 by yulian1987
[考研] 0703一志愿9，初试成绩：338，四六级已过，有科研经历，求调剂！ +8 Zuhui0306 2026-03-25 8/400 2026-04-01 09:38 by topgun2009
[考研] 调剂申请 +8 张张张张zy 2026-03-31 9/450 2026-04-01 08:29 by zjbkx
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +12 柳溪边 2026-03-26 13/650 2026-04-01 01:37 by 1018329917
[考研] 环境工程297分求调剂一志愿杭高院 +10 GENJIOW 2026-03-31 10/500 2026-04-01 01:30 by 1018329917
[考研] 一志愿西交大080500材料学硕349 +6 jqx1258 2026-03-31 7/350 2026-03-31 21:08 by yuq
[考研] 一志愿华东师范大学有机化学专业，初试351分，复试被刷求调剂! +9 真名有冰 2026-03-29 10/500 2026-03-31 18:01 by xhai2011
[考研] 085601英二数二求调剂 总分325 +4 余航航 2026-03-31 4/200 2026-03-31 17:38 by 唐沐儿
[考研] 287求调剂 +17 land xuxu 2026-03-26 17/850 2026-03-31 11:16 by Zzxxxs
[考研] 南京大学化学调剂 +11 景随风 2026-03-29 16/800 2026-03-31 10:14 by herarysara
[考研] 085601一志愿西北工业大学初试346 +4 085601初试346 2026-03-30 4/200 2026-03-31 07:47 by jp9609
[考研] 071010 323 分求调剂 +3 Baekzhy 2026-03-27 3/150 2026-03-30 14:24 by andresqi
[考研] 求调剂 +7 青春裁为三截 2026-03-29 7/350 2026-03-30 13:14 by laoshidan
[考研] 305求调剂 +8 RuiFairyrui 2026-03-28 8/400 2026-03-29 08:22 by fmesaito
[考研] 求调剂 +7 争取九点睡 2026-03-28 8/400 2026-03-28 21:07 by 争取九点睡
[考研] 071000生物学求调剂，初试成绩343 +7 小小甜面团 2026-03-25 7/350 2026-03-28 20:25 by 唐沐儿
[考研] 283求调剂 +3 A child 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:41 by ms629
[考研] 286求调剂 +12 PolarBear11 2026-03-26 12/600 2026-03-28 12:14 by zllcz
[考研] 081200-314 +3 LILIQQ 2026-03-27 4/200 2026-03-28 09:41 by 保护地球你我做�
[考研] 324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-26 5/250 2026-03-27 10:33 by wangjy2002
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭