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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 要愁死了，求帮助，筛选转化子的问题
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] 要愁死了，求帮助，筛选转化子的问题

将目的基因导入pET28a，选了8个单克隆做菌落PCR能P出来，但是提质粒后，用目的基因上的酶切位点酶切，居然切不断，大小和空质粒一样，怎么回事呀？我的目的基因到底有没有导进去？
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1楼 2013-01-04 14:33:42
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-04 15:50:21
一切以酶切结果为准，你是切不开呢，还是切开了，但是大小与空质粒一样，如果是后者的话，很明显，没有导进去，菌落PCR假阳性.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2013-01-04 15:17:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-04 15:50:33
菌落PCR有假阳性的，既然提质粒酶切鉴定不符合，肯定是不对的，要么多筛，要么从新克隆。
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3楼2013-01-04 15:32:52
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2013-01-04 15:17:58
一切以酶切结果为准，你是切不开呢，还是切开了，但是大小与空质粒一样，如果是后者的话，很明显，没有导进去，菌落PCR假阳性.

是切不开。请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢，我挑了8个克隆都能P出来，但都切不开
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4楼2013-01-04 15:49:47
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-04 15:32:52
菌落PCR有假阳性的，既然提质粒酶切鉴定不符合，肯定是不对的，要么多筛，要么从新克隆。

请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢？
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5楼2013-01-04 15:49:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-07 17:06:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-04 15:49:55
请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢？...

PCR是非常灵敏的技术，DNA模板量极少就可以扩增到通常的检测水平，所以任何PCR都可能出现假阳性的。比方说菌落PCR吧，一个细菌都可能能P出来的，你能保证试验中没有污染的菌源？做菌落PCR的时候要做阴性对照。很多人不喜欢做对照，事实上对照是非常重要的，实验可信性提高，而且出了问题也容易分析。
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6楼2013-01-05 08:18:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-04 15:49:47
是切不开。请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢，我挑了8个克隆都能P出来，但都切不开...

你做菌落PCR的时候是用的载体上的引物吗？最好有一个引物是克隆片段上的，一个在载体上，这样的话PCR的可信性非常高。
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7楼2013-01-05 08:35:22
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-05 08:35:22
你做菌落PCR的时候是用的载体上的引物吗？最好有一个引物是克隆片段上的，一个在载体上，这样的话PCR的可信性非常高。...

PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上，一个在载体上好呢？
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8楼2013-01-05 09:27:46
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Ag6501

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-05 09:27:46
PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上，一个在载体上好呢？...

PCR的引物一般这样设：上游：载体-目标基因一段

                      下游：目标基因-载体一段
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阳光倾城！
9楼2013-01-05 11:26:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-07 17:06:41
引用回帖:
8楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-05 09:27:46
PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上，一个在载体上好呢？...

都在克隆片段上也可以，不过有可能出现克隆片段P出假阳性的可能。如果一个在载体上，一个在目的基因上，假阳性的概率变小，而且保证你筛选的质粒既含有载体又含有目的片段。当然，最好是是象9L那样设计。但是一般的情况是你有克隆目的片段的引物，载体有通用引物，所以我说的这种引物组合是现成的，不需要另行设计。
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10楼2013-01-05 12:49:52
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