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cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] 要愁死了,求帮助,筛选转化子的问题

将目的基因导入pET28a,选了8个单克隆做菌落PCR能P出来,但是提质粒后,用目的基因上的酶切位点酶切,居然切不断,大小和空质粒一样,怎么回事呀?我的目的基因到底有没有导进去?
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-05 08:35:22
你做菌落PCR的时候是用的载体上的引物吗?最好有一个引物是克隆片段上的,一个在载体上,这样的话PCR的可信性非常高。...

PCR用的当初扩增目的基因的引物。
为什么PCR引物都在克隆片段上没有一个在克隆片段上,一个在载体上好呢?
8楼2013-01-05 09:27:46
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, 有帮助 2013-01-04 15:50:21
一切以酶切结果为准,你是切不开呢,还是切开了,但是大小与空质粒一样,如果是后者的话,很明显,没有导进去,菌落PCR假阳性.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2013-01-04 15:17:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, 有帮助 2013-01-04 15:50:33
菌落PCR有假阳性的,既然提质粒酶切鉴定不符合,肯定是不对的,要么多筛,要么从新克隆。
3楼2013-01-04 15:32:52
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2013-01-04 15:17:58
一切以酶切结果为准,你是切不开呢,还是切开了,但是大小与空质粒一样,如果是后者的话,很明显,没有导进去,菌落PCR假阳性.

是切不开。请教一下菌落PCR怎么来的假阳性呢,我挑了8个克隆都能P出来,但都切不开
4楼2013-01-04 15:49:47
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