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runhuahan

铜虫 (小有名气)


[求助] 请教关于构建克隆进行小RNA表达的问题

最近小弟在做构建克隆进行小RNA表达的实验,但是有几个问题想请教一下各位
1、如果我不知道sRNA的确切序列,只是尽量把这个sRNA连在载体上,也就是这个sRNA前后也有一些多余的序列一起连在表达质粒上,可不可行?
2、sRNA是单链的,连在载体上时是否有方向性,怎样确定这个方向性?
多谢各位了!!!!
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by runhuahan at 2012-12-12 10:15:48
pNM12或者pTRC99a,你有什么推荐的表达载体么?...

我们一般用的是PCDNA3.1,但是楼主这个是表达sRNA,我不太懂哎。。。嘿嘿。。。
keepon
9楼2012-12-13 09:17:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1. 有多余的序列不一定可以。主要看小RNA的二级结构,是否能与目的mRNA形成正确的杂合分子。
2. 连接当然有方向性。你需要给小RNA加一个强启动子或者可调控的,然后正向连入小RNA序列就是表达小RNA,连入reverse complement序列的话就是anti-sense了。
2楼2012-12-07 13:16:08
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runhuahan

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-07 13:16:08
1. 有多余的序列不一定可以。主要看小RNA的二级结构,是否能与目的mRNA形成正确的杂合分子。
2. 连接当然有方向性。你需要给小RNA加一个强启动子或者可调控的,然后正向连入小RNA序列就是表达小RNA,连入reverse c ...

谢谢你,但你说正向连入小RNA序列是表达小RNA,不是应该把编码小RNA的序列,也就是他的reverse complement序列连入,这样才能表达目的sRNA吧?
3楼2012-12-11 14:43:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by runhuahan at 2012-12-11 14:43:12
谢谢你,但你说正向连入小RNA序列是表达小RNA,不是应该把编码小RNA的序列,也就是他的reverse complement序列连入,这样才能表达目的sRNA吧?...

表达的序列是和你连入的序列一致的。转录时是以互补链为模板的。所以考虑一个基因的表达的RNA序列是和基因序列一致的,只是把T换成U。
4楼2012-12-11 14:51:03
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